HPLC法测定当归藤中儿茶素的含量

卢森华等

[摘要] 目的 建立当归藤中儿茶素的含量高效液相色谱法。方法 采用HPLC法进行测定，色谱柱为C18柱（5μm，4.6×250mm），流动相为甲醇-0.5%冰乙酸溶液（15︰85），检测波长为280nm。结果 儿茶素进样量在0.26～1.35?g之间与峰面积值呈现良好的线性关系，r=0.9997，平均回收率为98.26%，RSD为2.6%（n=6）。结论 所建立的含量测定方法可行，质量可控，稳定性良好。

[关键词] 当归藤；HPLC；儿茶素

[中图分类号] R917 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）01-117-03

当归藤为紫金牛科植物当归藤（Embelia parviflora Wall. ex A .DC.）的干燥根与老茎，别名小花酸藤子、筛箕蔃、土当归等。其味苦、涩，性温，具有补血、活血、益精壮阳、强腰膝的功效，常用于治疗血虚诸症、月经不调、闭经、产后虚弱、腰腿酸痛、跌打骨折等症[1-2]，在广西少数民族地区常将其作当归使用，故民间流传有“谁人懂得筛箕蔃，不愁不生养”之说，说明该药可治疗不孕症等[3]。当归藤还有温肾补血作用，广西特产中成药“桂龙药膏”以该药材为原料。有文献报道[4]从该药材的根茎乙醇提取物中分离得到4个结晶，其中3个鉴定为正三十烷酸乙酯、正三十烷酸及α-菠甾醇，另一个结晶初步分析为具侧链的羟基苯醌类成分。现代药理研究表明，儿茶素具有抗癌、抗氧化、抗诱变、抗糖尿病、抗菌消炎、抗衰老、降脂减肥等多种功能，并且其作为一种新型的天然抗氧化剂在食品领域中得到了广泛应用[5]。目前，关于该药材中儿茶素含量测定未见报道，本文建立了当归藤中儿茶素的含量测定方法，为当归藤的质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱议（美国安捷伦公司）；BP211D电子分析天平（德国赛多利斯）；C18柱（Diamonsil-2，5μm，4.6×250mm迪马公司）；LG-16W高速微量离心机（北京医用离心机厂）；SB2200-T超声波清洗器（上海必能信公司）。

1.2 试药

儿茶素对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号877-200001，供含量测定用）；水为超纯水，甲醇、乙腈（Fisher；色谱纯），冰乙酸（国药集团化学试剂有限公司，色谱纯）；提取用甲醇、乙醇（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[6]

色谱柱为C18柱（Diamonsil-2，5μm，4.6× 250mm，迪马公司），流动相为甲醇-0.5%冰乙酸溶液（15︰85），流速为0.8mL/min，柱温为30℃，检测波长为280nm，进样量为5?L，理论塔板数以儿茶素峰计算应不低于5000，分离度应大于1.5。

2.2 对照品溶液制备

精密取干燥至恒重的儿茶素对照品，称定重量为5.64mg，置25mL量瓶中，加适量甲醇超声使溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每毫升含儿茶素0.225mg）。

2.3 供试品溶液制备

取当归藤药材粉末约1g，精密称定，置于锥形瓶中，加入50%乙醇20mL，称重，超声提取1h，放冷，称定重量，用50%乙醇补足损失的重量，滤过，取续滤液约2mL至离心管中，10000转/min离心10min，取上清液备用，即得。

2.4 测定方法

分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液各5μL，在上述色谱条件下，供试品中儿茶素色谱峰与对照品色谱峰保留时间一致，并与其他共存成分分离度大于1.5。色谱图见图1、2。

2.5 线性关系考察

分别精密吸取上述儿茶素对照品溶液（0.225mg/mL）1、2、3、4、5、6μL进样，测定峰面积，以进样量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，并作最小二乘法线性回归，得回归方程：y=1118x+4.663，r=0.9997。结果表明儿茶素对照品浓度在0.26～1.35?g之间与峰面积值呈现良好的线性关系。

2.6 精密度试验

精密吸取儿茶素对照品溶液（0.225mg/mL）5?L，连续进样6次，测定峰面积，其平均峰面积值为1221.0，RSD为0.32%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一批药材粉末4份（产地：广西金秀），每份1g，精密测定，按供试品制备方法制备，测定峰面积并计算儿茶素含量，平均值为0.152%，RSD为0.38%。表明本法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取一份上述供试品溶液，每次精密吸取5?L，分别于1，2，4，6，12，24h进样，测定其峰面积值并计算儿茶素含量，儿茶素的平均峰含量为0.153%，RSD为0.65%，表明供试品溶液在24h内稳定性好。

2.9 加样回收试验

取已知含量的供试品6份（产地：广西金秀），每份约0.5g（含量为0.148%），精密称定，分别加入一定量的儿茶素对照品溶液，照供试品溶液制备方法处理并测定儿茶素含量，计算回收率，平均回收率为98.26%，RSD为2.6%。结果见表1。

2.10 样品含量测定

分别取不同产地当归藤药材粉末各一份，每份约1g，精密称定，按供试品制备方法处理，测定峰面积，计算儿茶素含量。结果见表2。

3 讨论

3.1 含测对象的选择

大量研究发现，儿茶素具有抗氧化、抗诱变、协同抗癌、抗心血管疾病、抗衰老、清除自由基和降脂减肥等多种生理功能，并在食品、化妆品领域中得到较广泛应用。我们在当归藤中发现含有可观的儿茶素含量，可作为含测对象；同时在选定的几种备选含测物质中儿茶素易得，价格便宜。

3.2 方法选择

管海波等[7]在对当归藤化学成分的研究过程中，分离得到大量的儿茶素，并利用紫外分光光度法测定了当归藤中儿茶素含量，但紫外分光光度法精密度低，所以本文用HPLC法测定儿茶素的含量。

3.3 色谱条件的选择

照紫外-可见分光光度法，在200～800nm扫描，结果在280nm处有最大吸收，故选280nm为测定波长。分别比较甲醇-水（15∶85）、乙腈-水（15∶85）、甲醇-0.5%冰乙酸（15∶85、10∶90、20∶80）几个系统，以甲醇-0.5%冰乙酸（15∶85）效果最好。分别设定20℃、25℃、30℃、35℃不同的柱温进行比较，在30℃条件下，峰分离效果最好[8]。分别考察了0.8、0.9、1.0mL/min不同流速下的色谱图，分离效果都很好，但以0.8mL/min测得的柱效最高，因此确定最佳流速为0.8mL/min。

3.4 提取方法选择

分别采用索氏静置、回流提取和超声提取进行比较，超声与回流提取效果差不多，考虑到用超声比较简单，故选超声；另分别考察了相同取样量以5%、30%、50%、70%、95%乙醇进行提取，50%乙醇提取效果较优[9]；另对超声提取时间进行比较，结果测得超声提取1h后趋于稳定，故选定提取时间为1h。

3.5 展望

儿茶素药理作用广泛，近几年对儿茶素的药理活性的研究越来越多，研究显示儿茶素有多样的生物活性，对多种疾病的预防与治疗都有使用价值，此外儿茶素与其他抗癌药联合使用具有增效作用，作为抗癌辅助治疗具有广阔的前景[10]。然而儿茶素类成分复杂，自身具有易氧化、易降解的生物学特性，体内与体外的研究结果并不完全一致，儿茶素类的手性研究及其体内与金属离子、蛋白质等物质的相互作用可能是今后研究的重点。鉴于儿茶素类物质具有良好的保健功能，各种儿茶素现已广泛使用在食品、保健品中，但目前儿茶素类作为单独药物应用于临床还有一定距离。我们相信随着构效关系、代谢动力学、作用机制等研究的深入，儿茶素类物质的应用可得到进一步深化。

[参考文献]

[1] 广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准（1990版）[S].南宁：广西科学技术出版社，1992：44.

[2] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999：76-77.

[3] 中国科学院中国植物志编委会.中国植物志[S].北京：科学出版社，1979：113.

[4] 陈家源，卢文杰，王雪芬，等.小花酸藤子化学成分的研究[J].华西药学杂志，1998，13（2）：95-96.

[5] 于莎莎，丁阳平，罗赛，等.儿茶素衍生物合成及药理作用研究进展[J].食品科学，2012，33（17）：318-326.

[6] 林俐莎，葛建，杨晶晶，等.高效液相色谱法测定茶叶中儿茶素含量[J].医药导报，2011，30（12）：1639-1641.

[7] 管海波，银小玲，覃江克，等.紫外分光光度法测定当归藤中儿茶素含量[J].安徽农业科学，2011，39（18）：10854-10855.

[8] 付静，江海，李新生.超高效液相色谱法测定绿茶中5种儿茶素[J].分析试验室，2012，27（4）：69-74.

[9] 高治平，刘刚，刘玉玲，等.马尾松松针儿茶素提取工艺研究[J].应用化学，2011，40（3）：420-424.

[10] 徐先祥.儿茶素的药理作用研究综述[J].郑州轻工业学院学报（自然科学版），2012，27（4）：60-64.

（收稿日期：2013-08-03）

3.2 方法选择

管海波等[7]在对当归藤化学成分的研究过程中，分离得到大量的儿茶素，并利用紫外分光光度法测定了当归藤中儿茶素含量，但紫外分光光度法精密度低，所以本文用HPLC法测定儿茶素的含量。

3.3 色谱条件的选择

照紫外-可见分光光度法，在200～800nm扫描，结果在280nm处有最大吸收，故选280nm为测定波长。分别比较甲醇-水（15∶85）、乙腈-水（15∶85）、甲醇-0.5%冰乙酸（15∶85、10∶90、20∶80）几个系统，以甲醇-0.5%冰乙酸（15∶85）效果最好。分别设定20℃、25℃、30℃、35℃不同的柱温进行比较，在30℃条件下，峰分离效果最好[8]。分别考察了0.8、0.9、1.0mL/min不同流速下的色谱图，分离效果都很好，但以0.8mL/min测得的柱效最高，因此确定最佳流速为0.8mL/min。

3.4 提取方法选择

分别采用索氏静置、回流提取和超声提取进行比较，超声与回流提取效果差不多，考虑到用超声比较简单，故选超声；另分别考察了相同取样量以5%、30%、50%、70%、95%乙醇进行提取，50%乙醇提取效果较优[9]；另对超声提取时间进行比较，结果测得超声提取1h后趋于稳定，故选定提取时间为1h。

3.5 展望

儿茶素药理作用广泛，近几年对儿茶素的药理活性的研究越来越多，研究显示儿茶素有多样的生物活性，对多种疾病的预防与治疗都有使用价值，此外儿茶素与其他抗癌药联合使用具有增效作用，作为抗癌辅助治疗具有广阔的前景[10]。然而儿茶素类成分复杂，自身具有易氧化、易降解的生物学特性，体内与体外的研究结果并不完全一致，儿茶素类的手性研究及其体内与金属离子、蛋白质等物质的相互作用可能是今后研究的重点。鉴于儿茶素类物质具有良好的保健功能，各种儿茶素现已广泛使用在食品、保健品中，但目前儿茶素类作为单独药物应用于临床还有一定距离。我们相信随着构效关系、代谢动力学、作用机制等研究的深入，儿茶素类物质的应用可得到进一步深化。

[参考文献]

[1] 广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准（1990版）[S].南宁：广西科学技术出版社，1992：44.

[2] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999：76-77.

[3] 中国科学院中国植物志编委会.中国植物志[S].北京：科学出版社，1979：113.

[4] 陈家源，卢文杰，王雪芬，等.小花酸藤子化学成分的研究[J].华西药学杂志，1998，13（2）：95-96.

[5] 于莎莎，丁阳平，罗赛，等.儿茶素衍生物合成及药理作用研究进展[J].食品科学，2012，33（17）：318-326.

[6] 林俐莎，葛建，杨晶晶，等.高效液相色谱法测定茶叶中儿茶素含量[J].医药导报，2011，30（12）：1639-1641.

[7] 管海波，银小玲，覃江克，等.紫外分光光度法测定当归藤中儿茶素含量[J].安徽农业科学，2011，39（18）：10854-10855.

[8] 付静，江海，李新生.超高效液相色谱法测定绿茶中5种儿茶素[J].分析试验室，2012，27（4）：69-74.

[9] 高治平，刘刚，刘玉玲，等.马尾松松针儿茶素提取工艺研究[J].应用化学，2011，40（3）：420-424.

[10] 徐先祥.儿茶素的药理作用研究综述[J].郑州轻工业学院学报（自然科学版），2012，27（4）：60-64.

（收稿日期：2013-08-03）

3.2 方法选择

管海波等[7]在对当归藤化学成分的研究过程中，分离得到大量的儿茶素，并利用紫外分光光度法测定了当归藤中儿茶素含量，但紫外分光光度法精密度低，所以本文用HPLC法测定儿茶素的含量。

3.3 色谱条件的选择

照紫外-可见分光光度法，在200～800nm扫描，结果在280nm处有最大吸收，故选280nm为测定波长。分别比较甲醇-水（15∶85）、乙腈-水（15∶85）、甲醇-0.5%冰乙酸（15∶85、10∶90、20∶80）几个系统，以甲醇-0.5%冰乙酸（15∶85）效果最好。分别设定20℃、25℃、30℃、35℃不同的柱温进行比较，在30℃条件下，峰分离效果最好[8]。分别考察了0.8、0.9、1.0mL/min不同流速下的色谱图，分离效果都很好，但以0.8mL/min测得的柱效最高，因此确定最佳流速为0.8mL/min。

3.4 提取方法选择

分别采用索氏静置、回流提取和超声提取进行比较，超声与回流提取效果差不多，考虑到用超声比较简单，故选超声；另分别考察了相同取样量以5%、30%、50%、70%、95%乙醇进行提取，50%乙醇提取效果较优[9]；另对超声提取时间进行比较，结果测得超声提取1h后趋于稳定，故选定提取时间为1h。

3.5 展望

儿茶素药理作用广泛，近几年对儿茶素的药理活性的研究越来越多，研究显示儿茶素有多样的生物活性，对多种疾病的预防与治疗都有使用价值，此外儿茶素与其他抗癌药联合使用具有增效作用，作为抗癌辅助治疗具有广阔的前景[10]。然而儿茶素类成分复杂，自身具有易氧化、易降解的生物学特性，体内与体外的研究结果并不完全一致，儿茶素类的手性研究及其体内与金属离子、蛋白质等物质的相互作用可能是今后研究的重点。鉴于儿茶素类物质具有良好的保健功能，各种儿茶素现已广泛使用在食品、保健品中，但目前儿茶素类作为单独药物应用于临床还有一定距离。我们相信随着构效关系、代谢动力学、作用机制等研究的深入，儿茶素类物质的应用可得到进一步深化。

[参考文献]

[1] 广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准（1990版）[S].南宁：广西科学技术出版社，1992：44.

[2] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999：76-77.

[3] 中国科学院中国植物志编委会.中国植物志[S].北京：科学出版社，1979：113.

[4] 陈家源，卢文杰，王雪芬，等.小花酸藤子化学成分的研究[J].华西药学杂志，1998，13（2）：95-96.

[5] 于莎莎，丁阳平，罗赛，等.儿茶素衍生物合成及药理作用研究进展[J].食品科学，2012，33（17）：318-326.

[6] 林俐莎，葛建，杨晶晶，等.高效液相色谱法测定茶叶中儿茶素含量[J].医药导报，2011，30（12）：1639-1641.

[7] 管海波，银小玲，覃江克，等.紫外分光光度法测定当归藤中儿茶素含量[J].安徽农业科学，2011，39（18）：10854-10855.

[8] 付静，江海，李新生.超高效液相色谱法测定绿茶中5种儿茶素[J].分析试验室，2012，27（4）：69-74.

[9] 高治平，刘刚，刘玉玲，等.马尾松松针儿茶素提取工艺研究[J].应用化学，2011，40（3）：420-424.

[10] 徐先祥.儿茶素的药理作用研究综述[J].郑州轻工业学院学报（自然科学版），2012，27（4）：60-64.

（收稿日期：2013-08-03）