应用基因芯片技术研究非毒性结节性甲状腺肿基因表达的初步研究

姚金科等

[摘要] 目的 筛查非毒性结节性甲状腺肿（NTNG）相关基因，探讨NTNG发生机制。 方法 分别抽提NTNG患者甲状腺组织及正常甲状腺组织总RNA，逆转录合成相应以Cy5和Cy3标记的探针与基因表达谱芯片进行杂交，扫描芯片荧光信号图像，用对扫描图像进行数字化处理和分析。利用实时荧光定量PCR技术对筛选出的部分表达差异明显的基因进行验证。 结果 筛选出表达差异明显的基因48个，其中NTNG组中表达上调的基因36条，表达下调的基因12条。荧光定量PCR结果与基因芯片一致。 结论 NTNG患者甲状腺组织与正常甲状腺组织之间存在明显的基因表达差异，为NTNG患者提供相当数量的与细胞外基质、细胞因子、受体信号转细胞信号传递等相关的差异表达基因，为NTNG早期诊断和治疗提供了线索。

[关键词] 寡核苷酸序列分析；非毒性结节性甲状腺肿；基因；差异表达

[中图分类号] R581.3 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）01-27-04

非毒性结节性甲状腺肿（nontoxic nodular goiter，NTNG）是一种常见的甲状腺疾病，发病率可高达6%～7%。以女性多见。与正常的甲状腺细胞相比，非毒性结节性甲状腺肿的甲状腺细胞在DNA、RNA水平上应有差异。利用这三方面的指标的差异，研究非毒性结节性甲状腺肿表达存在差异的相关基因的变化，有助于阐明其发生发展的机制。现利用基因芯片技术，初步研究分析筛选NTNG患者甲状腺组织及正常甲状腺组织之间差异表达的基因。

1 材料与方法

1.1 材料

所有标本均取自增城市人民医院2009年10月～2011年10月住院患者，年龄（38.3±8.3）岁。NTNG患者共10例（男4例，女6例）。正常对照10例取自无甲状腺病变患者的正常甲状腺组织（男7例，女3例）。均经病理确诊。将手术切除甲状腺标本立即冻存于液氮中。Trizol试剂盒（Invitrogen公司），BiostarH-I DNA芯片（上海联合基因公司），ScanArray 3000扫描仪（General Scanning公司），实时荧光定量试剂盒（日本TaKaRa公司），5700型实时荧光定量PCR仪（美国PE公司）。

1.2 总RNA抽提

总RNA抽提将每位NTNG患者甲状腺组织及正常甲状腺组织样本取100mg分别合并。总RNA提取按Trizol试剂盒操作指南进行。测定A260/A280，范围在1.8～2.0。用琼脂糖凝胶电泳（5.0V/cm，0.5h）检测总RNA质量，28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的2倍以上。

1.3 基因芯片

BiostarH-I DNA芯片，购自上海联合基因公司，该芯片共含基因1152条，其中1068条有效基因，48条管家基因， 20条内参基因，阴性对照及空白对照各8条，内容涉及细胞凋亡、原癌基因、受体信号转导等方面。

1.4 探针制备

将NTNG甲状腺组织和正常甲状腺组织总RNA分别逆转录成cDNA后作为探针以备与基因芯片杂交。探针的合成：用Superscript II逆转录酶，以及标记Cy5和Cy3的dUTP将总RNA逆转录成cDNA（其中Cy5用于标记NTNG甲状腺组织，Cy3标记正常甲状腺组织）。乙醇沉淀后溶解在20μL 5×SSC和0.2%SDS杂交液中。

1.5 杂交及洗涤

将杂交探针和基因芯片分别在95℃水浴中变性5min，然后将探针加在芯片上，用盖玻片封片；再置于杂交箱，60℃，杂交15～17h；然后揭开盖玻片，最后分别用2×SSC和0.2%SDS，0.1×SSC和0.2%SDS，0.1×SSC 洗涤10min，室温28℃晾干。

1.6 检测与分析

用ScanArray 3000扫描仪对杂交及洗涤制备良好的芯片进行扫描，将所得Cy5/Cy3图像，过滤背景噪声后，再提取基因表达的荧光信号强度值。应用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度和比值。提取预先选定的内参照基因的Cy3和Cy5的原始荧光信号，然后进行均衡和标准化处理修正，数据小于800的Cy3、Cy5信号均剔除。判断基因差异表达的标准：（1）Cy3和Cy5信号值其中之一必须大于800；（2）Cy3和Cy5信号比值的自然对数的绝对值（Ratio） >0.69（基因表达变化在2倍以上）。

1.7 实时荧光定量

PCR检测MMP-9、p27的表达：采用嵌合荧光检测法，按照5700型实时荧光定量PCR仪及实时荧光定量试剂盒（日本TaKaRa公司）的操作说明进行。采用50μL 反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM （2×）25μL；PCR Forward Primer 2 μL；PCR Reverse Primer 2μL；ROX Reference Dye（50×）1μL；模板cDNA 4μL；以去离子水补足50μL设置反应条件。主要步骤：（1）预变性：95℃，30sec，1循环；（2）PCR：95℃ 5sec，60℃ 20sec，共40个循环；（3）融解曲线分析：95℃ 0sec，65℃ 15sec，95℃ 0sec。每个标本均平行扩增5管，包括MMP-9、p27和β-actin。每次扩增均制作标准曲线，以MMP-9，p27和β-actin的CT比值作为其相对表达水平。

1.8 统计学处理

使用SPSS15.0统计软件处理数据。采用成组设计两样本t检验比较NTNG甲状腺组织和正常甲状腺组织的MMP-9、p27相对表达，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 基因表达谱分析结果endprint

Cy3荧光信号和Cy5荧光信号分别标记正常甲状腺组织和NTNG甲状腺组织并分别以绿色和红色表示，对于某一点的两种叠加荧光信号，如果Cy3信号较强呈下调趋势，该点多显绿色；如果Cy5信号较强呈上调趋势，该点多显红色；如果强度相似，即显示黄色。通过基因表达谱比较发现正常甲状腺组织和NTNG甲状腺组织基因表达差异2倍以上共有48条，表达上调有36条，下调12 条。其中表达上调的有：MMP-9、 Akt、AnnexinⅡ、bcl-2、Bmi-1、CK19、c-met、c-myc、COx-2、CyclinD1、Ki67、Gal-3、HBME-1、HMGB1KISS-1、MMP-2、TIMP-1、MUC1、P13K、P53 、pAkt、RARβ、Ras、S100A4、Smac、t-PA、TSGF、TSHR、VEGF-C、β-catenin、雌激素受体a亚型（ERa）、多态性上皮粘蛋白（polymorphic epithelial mucin，PEM，又名MUC1）、分化抑制蛋白-1（Id-1）、高分子量角蛋白（34βe12）、唾液酸化路易斯-X（SLeX）；下调的有：p27、Rb、NIS、APC、Caspase-7、Fas、MLH1、P21WAF1、金属蛋白酶抑制基因RECK、磷酸化eIF4E结合蛋白1（p-4EBP1）、真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）、DAPK1。

2.2 FQ-PCR鉴定MMP-9、p27的表达

NTNG甲状腺组织的MMP-9相对表达量和正常甲状腺组织相比较，差异有统计学意义（P<0.05）；NTNG甲状腺组织的p27相对表达量和正常甲状腺组织相比较，差异有统计学意义（P<0.05）；NTNG甲状腺组织的MMP-9基因表达水平高于正常甲状腺组，NTNG甲状腺组织的p27基因表达水平低于正常甲状腺组，与基因芯片结果是一致，详见表1。

3 讨论

非毒性结节性甲状腺肿是一种分布广泛的世界性疾病，发病率可高达6%～7%[1-2]，以女性多见。NTNG伴发甲状腺癌一向受到重视，其发生率可高达4.0%～17.0%[3]。尽管如此，NTNG中存在甲状腺癌已是不争的事实。研究者普遍认为，NTNG的致病机制与激素、生长因子和甲状腺滤泡的功能异质性等因素有关。但这些研究多是从某一方面的，指标比较单一，具有一定的局限性。基因芯片（Gene chip）技术特点是高通量、高集成、微型化和自动化。目前基因芯片已被广泛应用于肿瘤[4-10]、代谢[11-12]、药物治疗等领域的研究中，尤其在肿瘤研究中得到更为广泛的应用，推动了肿瘤发生、发展的分子机制的研究，在甲状腺癌中已有学者进行了初步研究[13-15]。本研究利用基因芯片研究发现，在NTNG与正常甲状腺组织之间存在较多的表达差异明显的基因。其中显著差异表达基因共有48条，表达上调有36条，下调12 条。表达上调的有：MMP-9、 Akt、AnnexinⅡ、bcl-2、Bmi-1、CK19、c-met、c-myc、COx-2、CyclinD1、Ki67、Gal-3、HBME-1、HMGB1KISS-1、MMP-2、TIMP-1、MUC1、P13K、P53 、pAkt、RARβ、Ras、S100A4、Smac、t-PA、TSGF、TSHR、VEGF-C、β-catenin、雌激素受体a亚型（ERa）、多态性上皮黏蛋白（polymorphic epithelial mucin，PEM，又名MUC1） 、分化抑制蛋白-1（d-1）、高分子量角蛋白（34βe12）、唾液酸化路易斯-X（SLeX）；下调的有：p27、Rb、NIS、APC、Caspase-7、Fas、MLH1、P21WAF1、金属蛋白酶抑制基因RECK、磷酸化eIF4E结合蛋白1（p-4EBP1）、真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）、DAPK1。其中FQ-PCR鉴定MMP-9、p27的表达，与基因芯片结果是一致。目前MMP-9在NTNG研究中很少报道，多数的研究生发现其与肿瘤的侵袭转移有关，亦有学者在良性组织的研究中发现MMP-9对良性病变有一定的作用。程青等[16]指出肺气肿模型组MMP-9和TIMP-1的表达与正常对照组相比明显增强，且MMP-9/TIMP-1比值失衡，结论MMP-9/TIMP-1失衡在肺气肿形成中起重要作用。詹阳等[17]发现在正常甲状腺组织、良性甲状腺结节和甲状腺乳头状癌中MMP-9 mRNA表达随着细胞异型性的增加呈上调的趋势。本组在NTNG中MMP-9亦为上调。从本组研究表明NTNG发生发展可能与细胞外基质、细胞因子、受体信号转细胞信号传递等相关的差异表达基因有关。其发生与多种因素有关，但由于研究的样本有限，需进一步扩大研究。虽然有的基因其差异表达的意义还不很清楚，但为深入研究NTNG的发生发展机制提供了有价值的线索，在寻找NTNG的发病基因及治疗方面具有积极的意义。

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