鲍曼不动杆菌及其耐药基因的检测

张小洁　肖春红　袁建芬等

[摘要] 目的 探索一种检测鲍曼不动杆菌及其耐药基因的新方法。 方法 首先对近几年医院内鲍曼不动杆菌的耐药情况进行分析，选择临床上治疗鲍曼不动杆菌的首选药，再采用聚合酶链反应对鲍曼不动杆菌及其突变株进行检测。 结果 鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率最低，为9.37%，OXA-51基因扩增结果与细菌培养相符，OXA-23基因扩增与鲍曼不动杆菌耐亚胺培南的结果相符。 结论 采用PCR法对OXA-51基因扩增可以检测是否存在鲍曼不动杆菌，采用PCR法对OXA-23基因扩增可以检测鲍曼不动杆菌是否存在亚胺培南耐药性。从而快速检测鲍曼不动杆菌及其耐药基因，指导临床用药。

[关键词] 细菌；耐药性；聚合酶链反应；鲍曼不动杆菌

[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）02-25-04

随着抗生素的长期使用，耐药菌不断出现，特别是多重耐药菌的出现已引起社会的广泛重视。2011年初卫生部专门发文要求各级医院重视多重耐药菌的监测。而鲍曼不动杆菌（acinetobacter baumannii，Ab）是主要引起医院感染的多重耐药菌之一。鲍曼不动杆菌为条件致病菌，可引起多种临床感染，其分离率在非发酵菌中仅次于绿脓假单胞菌，常导致严重的医院感染如菌血症、脑膜炎或肺炎。由于抗生素的过度使用，使得鲍曼不动杆菌产生多重耐药[1-11]，甚至出现了泛耐药株，且耐药性呈逐年上升趋势，已引起人们的关注。

鲍曼不动杆菌对青霉素类、头孢菌素、环丙沙星、复方新诺明等耐药率均超过80%，对亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦敏感性较高。目前主要采用培养方法[12]进行检测，而其他检测方法的临床应用还未见。

本研究首先对近几年医院内鲍曼不动杆菌的耐药情况进行分析，选择临床上治疗鲍曼不动杆菌的首选药，然后采用聚合酶链反应对鲍曼不动杆菌及其突变株进行检测，同时采用培养法进行联合检测。以指导临床用药、防治院内感染的蔓延。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

从2009年6月～2011年12月本院患者送检的标本（痰液、咽拭子、脓液、尿液、胸水、血液）中共分离到鲍曼不动杆菌32株（经德灵公司AUTO Scan4全自动细菌鉴定系统鉴定确认）。质控菌株包括金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853购自卫生部临床检验中心。

1.2 细菌药物敏感纸片

哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦、亚胺培南、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星均购自英国Oxoid公司。

1.3 主要试剂和仪器

AUTO Scan4全自动细菌鉴定系统（德灵公司）、ZF紫外透射反射分析仪（上海康华生化器械厂）、Opticon 2 PCR扩增仪器（MJ公司）、GE-100电泳仪（杭州博日公司）。

MH琼脂平板、血液琼脂培养基干粉均购自杭州天和微生物试剂有限公司，直接DNA裂解液购自上海申友生物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 主要试剂的配制 （1）10×TBE缓冲液：称取Tris 108g、硼酸55.0g，加入0.5mol/L EDTA（pH 8.0） 20mL定容至1000mL，在室温下储存。工作液为0.5×TBE缓冲液，加蒸馏水稀释20倍即可。

1.4.2 细菌的培养、鉴定 按照《全国临床检验操作规程》第3版常规方法进行。根据菌落形态、革兰染色和氧化酶等试验，通过德灵公司的微生物鉴定系统的革兰阴性菌GN卡鉴定为鲍曼不动杆菌。

1.4.3 药物敏感试验 采用纸片扩散（K-B）法。根据美国临床实验室标准化委员会（clinical laboratory standards institute，CLSI）2009年标准进行操作和判读结果。

1.4.4 DNA的提取 采用蛋白酶K法：挑取血平板上纯培养的单个菌落置入内含无菌生理盐水（50μL）的0.2mL离心管中，浓度约为0.5麦氏单位，加入10μL蛋白酶K（200ng/mL）、50μL直接DNA裂解液，，55℃水浴0.5h，改100℃水浴10min，15000r/min离心30s，移液器吸取上清液。

1.4.5 PCR引物引物 OXA-51、OXA-23引物均由上海生工生物技术有限公司合成，扩增产物分别为353 bp 和1036 bp 的DNA 片段，

OXA-51基因引物参照郭萍[13]（鲍曼不动杆菌固有基因）：

引物1 5-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3引物2 5-TCCATTCCACTTCATCTTGG-3。

OXA-23基因引物参照邹玖明[14]：引物1 5-GATGTGTCATAGTATTCGTCG-3引物2 5-TCACAACAACTAAAAGCACTG-3。

1.4.6 PCR扩增 在0.2mL无菌离心管中行加入25μL反应混合物，其终成份为50mmol/L KCl，10mmol/LTris-HCl（pH8.3），0.01%明胶，0.1%TritonX-100，1.5mmol/LMgCl2，各200μmol/L dNTPs，各0.2μmol/L引物1，2。再加入1μL Taq DNA聚合酶，最后加入5μL制备好的DNA模板，混匀离心数秒钟。

热循环参数为：94℃预变性5min，然后94℃ 50s，52℃ 40s，72℃90s，循环35周期，最后72℃延伸6min。

1.4.7 琼脂糖电泳 在50mL 0.5×TBE中加入1g琼脂糖，加热溶解制得2%的琼脂糖溶液。待溶液冷却到55℃左右，加2μL溴化乙啶溶液（10mg/mL）；制成凝胶槽，放入盛有0.5×TBE缓冲液的电泳槽中，凝胶应完全被缓冲液覆盖。取PCR扩增产物和DNA Marker进行琼脂糖凝胶电泳，加样量为每孔5μL，同时每个样品用溴酚兰作为指示剂，PCR扩增产物或者5μL DNA Marker，电泳电压为120V，电泳时间为30min（可以看到溴酚兰大约离加样孔1cm处），在紫外反射仪上观察结果。

2 结果

2.1 耐药率

经x2检验，亚胺培南与其他药物差异有统计学意义（P<0.05），哌拉西林/他唑巴坦与氨苄西林/舒巴坦之间差异无统计学意义（P>0.05），但与其他药物差异有统计学意义（P<0.05）。试验说明，鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率最低，为9.37%。见表1。因此在本院应将亚胺培南作为治疗鲍曼不动杆菌的首选药。

3 讨论

鲍曼不动杆菌及条件致病菌广泛存在于医院环境中，被认为是院内感染的主要病原体之一，可引起菌血症、呼吸机相关性肺炎等。本院近4年来鲍曼不动杆菌耐药趋势表明对亚胺培南耐药率最低，对氨苄西林/舒巴坦和哌拉西林/三唑巴坦的耐药率较低，均明显低于其他受试抗菌药物（表1），因此在本院应选亚培胺南类药物作为治疗鲍曼不动杆菌的首选药。

鲍曼不动杆菌主要在住院患者标本中检出，耐药率逐年上升。而耐药率的上升与鲍曼不动杆菌复杂的耐药机制密切相关[15-16]，主要包括：产生抗生素纯化酶、抗菌药物作用靶位发生改变、细菌胞壁通透性改变及主动外排系统活性增强等[15-16]。这些耐药机制可以单独作用或协同作用，使鲍曼不动杆菌对抗菌药物产生交叉耐药和多重耐药。β-内酰胺酶基因是鲍曼不动杆菌最主要的耐药基因[17]，其余还有与喹诺酮类抗生素有关的DNA旋转酶A亚单位基因（gyrA）、拓扑异构酶Ⅳ的C亚单位基因（parC）；与四环素类有关的Tet（A2E）、TetK、TetB、）TetM和TetO基因。亚培胺南是碳青霉烯类药物，其产生耐药主要与β-内酰胺酶基因产生突变有关。OXA-23型基因[14，18]属于D类第二组中的2df亚组，主要存在于鲍曼不动杆菌中。OXA-23型酶水解碳青霉烯使菌株产生对亚胺培南类抗生素的耐药性。本研究对耐亚胺培南的三株鲍曼不动杆菌OXA-23基因的PCR扩增证实了这一点。国内外[13，19]均有研究报道鲍曼不动杆菌的OXA-51属于鲍曼不动杆菌的固有基因与其耐碳青霉烯类的关联性不大，可用来检测鲍曼不动杆菌。本研究对4析鲍曼不动杆菌的扩增也证实了这一点。

目前，国内外鲍曼不动杆菌的药物敏感试验仍以培养为主。这也是确诊鲍曼不动杆菌的“金标准”，并且伴随先进的全自动血培养仪器在国内三级医院的逐渐普及，血培养在早期获得病原体诊断能力上获得显著提高，血培养的价值获得临床上一致承认。然而，无论是先进的血培养仪器法还是传统的手工培养方法，都是基于细菌的生长繁殖这一现象作为前期检测条件，其本身具有难以克服的缺陷，主要表现为：采集前抗生素使用、样本中细菌浓度低以及血液中的某些杀菌物质的作用等诸多因素所导致的培养阳性率低。因此培养在一定程度上仍然满足不了临床上快速诊治和院内感染的需要。且鲍曼不动杆菌主要存在于痰液、咽拭子、脓液、尿液、胸水等标本中。因此必须快速检测是否存在鲍曼不动杆菌，以治疗患者，特别是防止院内感染的蔓延就成为一个紧迫的问题。而这就需要建立一个敏感性高、特异性好的方法来检测鲍曼不动杆菌及其耐药株。

而分子生物学技术迅速发展和病原体基因组研究的深入为快速诊断病原体提供有力的手段。以聚合酶链反应（PCR）为代表的分子生物学技术应用于病原体的诊断，极大缩短了病原体诊断时间，提高了病原体诊断的特异性和灵敏性。本研究通过分析本院的鲍曼不动杆菌的耐药性情况，找到治疗首选药亚胺培南类药物。再采用PCR扩增鲍曼不动杆菌OXA-51基因及耐亚胺培南药有关的鲍曼不动杆菌OXA-23基因及时为临床治疗提供了指导，同时结合后继的培养可以有效的防治鲍曼不动杆菌在医院内的感染与流行。

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（收稿日期：2013-09-26）

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（收稿日期：2013-09-26）