一种新型贻贝抗菌肽的分离纯化及鉴定

孙敬敬刘慧慧周世权王信超范美华申 望廖 智

(1. 浙江海洋学院海洋科学学院, 海洋生物资源及分子工程实验室, 舟山 316004; 2. 舟山医院-中科院北京基因组研究所免疫基因组学联合实验室, 舟山 316004)

一种新型贻贝抗菌肽的分离纯化及鉴定

孙敬敬1刘慧慧1周世权2王信超1范美华1申 望1廖 智1

(1. 浙江海洋学院海洋科学学院, 海洋生物资源及分子工程实验室, 舟山 316004; 2. 舟山医院-中科院北京基因组研究所免疫基因组学联合实验室, 舟山 316004)

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)广泛分布于我国东部海域, 其体内富含各种抗菌肽分子, 是研究软体动物免疫防御机制以及开发抗菌肽来源的新型生物抗生素的重要对象。采用多步反相高效液相色谱对厚壳贻贝血清进行分离纯化, 获得一种分子量为6261.55 D的具有抗菌活性的多肽成分; 经多肽N端测序和基因克隆,结果表明该抗菌肽由55个氨基酸残基构成, 含6个半胱氨酸并形成三对二硫键。结构域分析表明该抗菌肽具有几丁质结合结构域(Chitin-biding domain), 因此将该抗菌肽命名为mytichitin-A。Mytichitin-A对革兰氏阳性菌具有较强的抑制作用, 同时对真菌及革兰氏阴性菌也具有抑制作用。荧光定量 PCR检测表明, mytichitin-A主要在厚壳贻贝的性腺组织中表达且在细菌诱导后12h其表达量达到峰值。研究为深入了解厚壳贻贝抗菌肽的分子多样性及免疫机制奠定了基础。

厚壳贻贝; 抗菌肽; 几丁质结合结构域; 荧光定量PCR

抗菌肽是一类具有抗菌活性的多肽类分子,分子量通常小于10 kD, 由20—60个氨基酸残基组成[1,2]。抗菌肽是生物抵御外界环境微生物的入侵的重要手段, 也是目前新型生物抗生素研发的候选分子。目前, 人们分别从植物[3]、无脊椎动物[4]和脊椎动物[5]的不同类型组织和细胞中分离到为数众多的抗菌肽, 通过模拟天然抗菌肽结构的人工设计和改造的抗菌肽更是不计其数。目前, 在美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的蛋白质数据库中, 以“抗菌肽”作为关键词所搜索到的序列数总计达到16万余条, 包括天然蛋白质及其前体基因序列, 以及人工合成的抗菌肽序列等。生物中广泛存在的抗菌肽分子也表明了抗菌肽作为先天免疫的效应因子在生物体免疫系统中有着至关重要的作用[6,7]。

海洋生物由于其所处水环境的微生物多样性和复杂性, 其体内因此富含各种抗菌肽分子, 海洋生物抗菌肽研究在生物抗生素的研发中具有重要地位。贻贝属于软体动物门, 双壳纲, 贻贝科; 贻贝缺乏特异性免疫系统, 其免疫防御手段主要依赖于体内各种类型的抗菌肽分子。贻贝抗菌肽历来是海洋生物抗菌肽研究中的一个重要对象, 也是目前海洋生物抗菌肽研究中发现抗菌肽家族种类最多的物种之一。目前已报道的贻贝抗菌肽蛋白序列和基因序列可归纳为7个家族, 超过100个成员, 主要来自地中海贻贝(Mytilus galloprovincialis)、紫贻贝(Mytilus edulis), 以及加利福尼亚贻贝(Mytilus californianus)等。贻贝抗菌肽家族主要包括Mytilin (包括Mytilin A, B, C, D和G1)[8]、Mytimycin[8]、MGD(包括MGD-1和MGD-2)[9—11]、Myticin (myticin A, B, C)[12]、Myticusin[13]、big defencin 和 mytimacin[14]。上述贻贝的不同抗菌肽家族成员具有各自不同的抗菌谱,例如MGD与Myticin A主要对革兰氏阳性菌以及对虾白斑病毒等有强的杀菌活性, 对革兰氏阴性菌和真菌的抑制作用较弱[10—12]; Mytimycin则具有较强的抗真菌活性[8]; Mytilin B、C、D则对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的有效抑菌浓度无明显区别; 而Mytilin G1则只对革兰氏阳性菌具有抗菌活性; 此外, Mytilin B、D以及Myticin B还具有强的抗真菌活性[13]。贻贝抗菌肽的分子多样性特征表明, 贻贝可组合利用不同的抗菌肽分子以抵御外界不同的微生物侵袭[15,16]。

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)广泛分布于我国东部海域, 具有重要经济价值。在前期研究中, 我们通过多维色谱方法结合抗菌活性检测和质谱鉴定,从其血淋巴中鉴定到厚壳贻贝中一种分子量超过10000 D 的新型抗菌肽 myticusin-1[13]以及三种Mytilin家族抗菌肽成分[17]。本研究通过高效液相色谱结合质谱技术和微量蛋白质测序, 获得一种此前尚未报道过的新型抗菌肽分子并克隆了其全长cDNA基因, 因其序列中含有几丁质结合结构域(Chitin-biding domains), 我们将该新型抗菌肽分子命名为 mytichitin-A; 该新型抗菌肽对多种革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌均具有较强的抑制活性; 荧光定量PCR分析表明, mytichtin-A主要在性腺组织表达, 经剪切后其成熟肽释放至血清以发挥抗菌活性。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

成年厚壳贻贝(M. coruscus)采自浙江舟山东极岛海域, 以洁净海水在通氧条件下饲养于恒温水族箱(18—20 )℃。

所用细菌和真菌购自北京中国普通微生物菌种保藏管理中心; 三氟乙酸(TFA)、α-氰基-4-羟基-肉桂酸(CCA)为Sigma公司产品; 蛋白质N端测序试剂为美国Applied Biosystems公司产品;乙腈(色谱纯)为美国TEDIA公司产品; Taq酶为Ferments公司产品; dNTP、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、氨苄青霉素(Ampicillin)购自上海捷瑞公司; 其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。实验用去离子水由密理博(Millipore synergy)纯水系统(法国 Millipore公司)制取。

1.2 实验方法

厚壳贻贝的诱导与血清的收集 厚壳贻贝血淋巴的采集参照参照文献[9]方法进行。以灭活的大肠杆菌在贻贝后闭壳肌处注射进行诱导, 诱导 24h后, 以内含抗凝剂(Alsever溶液)的注射器从其后闭壳肌至围心腔处抽取血淋巴; 4℃下立即离心(800 g, 15 min)以去除血细胞及其他不溶性杂质; 收集上清液, 以含0.1% TFA的去离子水按1∶1比例稀释后,调pH至3.75, 在4℃搅拌20 min后再次离心(4 , ℃10000 g, 20 min), 上清于–20℃冰箱保存备用。

抗菌肽的分离纯化 采用Waters 600E型高效液相色谱对厚壳贻贝血清进行分离纯化, 检测器为Waters 2487型紫外检测器, 采用双波长检测(280和254 nm)。

采用美国 Waters公司 SunfireTMPrep C8(10× 250 mm)半制备反相色谱柱进行分离。洗脱液分别为含0.1%TFA的去离子水(A液)和含0.1%TFA的乙腈(B液); 线性梯度洗脱(20分钟内乙腈浓度从 5%上升至60%); 流速3 mL/min, 分别收集洗脱液, 冷冻干燥后进行抗菌活性检测; 对上述步骤中具有抗菌活性的洗脱峰组分采用218TP54 C18(4.6×250 mm, Vydac公司)分析型反相色谱柱进行进一步反相高效液相色谱分离, 洗脱液分别为去离子水(A液, 含0.1%TFA)和乙腈(B液, 含 0.1%TFA); 线性梯度洗脱方式, B液比例在50min内从20%上升至40%, 流速0.75 mL/min, 收集各洗脱峰经冷冻干燥后进行抗菌活性检测。

抗菌活性检测 参照文献[9]方法, 采用酶标仪(MK3型, 美国热电公司)结合细菌生长曲线抑制法(Liquid growth inhibition assay)检测抗菌肽的抗菌活性。其中, 革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄蝶球菌(Sarcina luteus),巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis); 革兰氏阴性菌为大肠杆菌(Escherichia coli)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi); 真菌为白色念球菌(Candida albicans)和白假丝酵母(Monilia albican)。菌种于基础肉汤培养基中培养质菌体浓度达A600=0.001。取90 μL悬浮菌液与10 μL样品溶液混合, 抗菌肽样品事先溶于培养基中, 经倍比稀释后分别加入至悬浮菌液中并置于于96孔板; 30℃条件下孵育12h后在酶标仪上测定A600。根据A600值判断细菌的生长状况; 最终确定最小抑菌浓度范围(MIC)。MIC值用(a–b)形式表示, 其中(a)表示细菌能正常生长的最高样品浓度; (b)表示完全抑制细菌生长所需样品的最低浓度。

质谱分析 利用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF)鉴定蛋白质的精确分子量,质谱仪为美国 Applied Biosystems公司的 Voyager-DE™ STR Biospectromitry™ 质谱工作站。N2光源337 nm; 离子加速电压为20000 V, 采用线性阳离子模式检测, 所用基质为CCA。通过以下方式制备样品: 首先将CCA溶于含 0.1%TFA的50%乙腈溶液中至过饱和, 取1 μL 样品液加入到9 μL CCA溶液,混匀后取1 μL点样, 室温干燥后测定, 并采用内标法校正分子量。

氨基酸序列分析 蛋白质氨基酸序列测定采用N-端Edman降解法在美国Applied Biosystems公司的491-A型气相测序仪上完成。参照仪器说明书以标准程序测序, 测32个循环, 在线反相高效液相色谱分离氨基酸, 结合氨基酸标准图谱判断氨基酸种类, 最终准确读出所测样品的氨基酸序列。

通过 http://www.expasy.org/tools/#primary在线分析蛋白质的理论分子量和等电点; 通过 http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行序列搜索与比对;结构域分析利用SMART软件在线进行(http://smart. embl-heidelberg.de/); 蛋白质三级结构预测采用SWISS-Model软件在线(http://swissmodel.expasy. org/ )进行[18]。

基因克隆 将mytichitin-A已知的N端31个氨基酸残基的序列采用tblastn工具搜索NCBI网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)的贻贝(Mytilus)EST文库, 获得与其完全匹配的 EST序列(数据库编号: gb|ES407161.1|), 该EST序列来自加利福尼亚贻贝。结合该EST序列以及mytichitin-A的N端部分氨基酸序列, 设计两条特异性上游引物(Mytichitin-F-1: 5′-TACCAAGACCAACAACTACA-3′; Mytichitin-F-2: 5′-CCTAAAATGTGGCATGAATGG-3′); PCR反应所用下游引物分别试剂盒所带引物, 分别为3′RACE-R1 (5′-GTTTTCCCAGTCACGACTTTTTTT TTTTTTT-3′) 和3′RACE-R2(5′-GTTTTCCCAGTCAC GAC-3′)。以厚壳贻贝性腺组织总 RNA为模板, 采用Takara公司的3′-RACE试剂盒, 按照其说明书进行操作, 采用两步法克隆mytichitin-A的3′端cDNA序列。

根据上述步骤中克隆到的mytichitin-A的3′端cDNA基因序列, 设计特异性下游引物(5′-RACE-R: 5′-GTTCTCAATCTAATATTCCAAAGTCA-3′), 采用北京全式金公司的RACE试剂盒(SUPERSWITCH™ RACE cDNA Synthesis Kit)进行5′-RACE扩增, 操作步骤按照试剂盒说明书进行, 以试剂盒自带的5′-RACE上游接头引物和mytichitin特异性引物5′-RACE-R配对进行mytichitin的5′-端cDNA基因的扩增。将3′-RACE和5′-RACE获得的序列进行拼接,从而获得mytichitin-A的cDNA全序列。

2 结果

2.1 厚壳贻贝新型抗菌肽mytichitin-A的分离纯化

厚壳贻贝血淋巴经半制备型C8柱反相分离后,洗脱图谱见图1A。其洗脱峰主要集中在乙腈浓度为20%—35%的区域。以每两分钟收集一管洗脱液, 经抗菌活性测试, 发现在乙腈浓度 28%—30%时(图1A中星号标注)洗脱的成分具有较强的抗菌活性;收集该部分洗脱液, 进一步以分析型C18反相柱进行分离, 收集各洗脱峰进行抗菌活性测试, 结果表明, 乙腈浓度为25%时的洗脱成分(图1B星号标注)具有较强抗菌活性; 质谱分析表明, 该成分纯度较高, 其单同位素峰分子量为6261.55 D (图1C); 收集该成分进行蛋白质氨基酸序列测定, 获得其N端31个氨基酸残基的序列(图1C)。

2.2 Mytichitin-A的序列分析

根据mytichitin-A 已测得的N端31个氨基酸残基序列, 设计特异性引物, 采用 3′-RACE方法, 获得其3′端cDNA基因序列, 由此推导出mytichitin-A的C端完整的氨基酸序列。进一步通过5′-RACE技术获得mytichitin-A的5′-端cDNA基因序列。经序列拼接后, 我们发现, 所克隆到的 mytichitin-A 的cDNA序列由1558个核苷酸组成, 包括3′端的多聚A序列 (Genebank编号: KF675770); 其加尾信号(AATAAA)位于多聚腺苷酸上游15个核苷酸处; 其开放阅读框编码一条446个氨基酸残基组成的前体肽; 其中, 信号肽由N端25个氨基酸残基组成; 成熟肽区C端55个氨基酸残基为mytichitin-A抗菌肽,其中N端31个氨基酸残基的序列与蛋白质测序仪测定的序列完全一致, 表明基因克隆是成功的。mytichitin-A的序列中含有10个碱性氨基酸(Arg和Lys)以及 3个酸性氨基酸(Asp), 是一种典型的阳离子抗菌肽, 其等电点为9.18; mytichitin-A的序列中含 6个半胱氨酸, 其半胱氨酸分布模式为 C-X7-CX9-C-X7-C-X9-C-X11-C(X代表非半胱氨酸, C代表半胱氨酸, 数字代表氨基酸数目); 结构域分析表明, mytichitin-A序列中第17到第55个氨基酸残基为几丁质结合结构域(chitin-biding domain); 三级结构预测结果表明, mytichitin-A的三维结构主要包含四段反平行β-折叠(图2)。 2.3 Mytichitin-A的抗菌活性

图1 厚壳贻贝血清反相高效液相色谱分离图谱Fig. 1 M. coruscus serum separated by RP-HPLC

Mytichitin-A抑菌试验结果见表1。Mytichitin-A对革兰氏阳性菌有明显的抑制作用, 其最低抑制浓度(MIC)低于5 μmol/L; 对革兰氏阴性菌的抑制作用较弱, 其MIC值在25 μmol/L以上; 此外, mytichitin对于真菌也具有一定的抑制作用。2.4 Mytichitin-A的表达分析

通过荧光定量PCR技术分析了Mytichitin基因在厚壳贻贝血细胞、消化腺、外套膜、后闭壳肌、物抗菌肽研究的重要对象之一。由于贻贝生存的水环境具有极为复杂的微生物体系, 同时贻贝又不具备后天免疫系统, 因此, 抗菌肽对于贻贝的生存极为重要。当前, 已经从贻贝体内鉴定的抗菌肽种类主要包括从血淋巴中分离到的 mytilin、MGD、myticin、mytimycin等4大家族[15]; 此外, Macro, et al.采用RNA深度测序技术从地中海贻贝的外套膜、消化腺、腮等组织中克隆到大防御素(Big defencin)以及 mytimacin两类抗菌肽家族的基因[14]; 本实验室在前期从厚壳贻贝血细胞中鉴定到一种分子量超过10000 D的抗菌肽myticusin-1[13]。上述研究表明, 贻贝体内的抗菌肽呈现明显的分子多样性。

通过多步高效液相色谱结合抗菌活性测试, 我们从厚壳贻贝血淋巴中分离到一种新型抗菌肽分子,命名为 mytichitin-A。通过 Edman降解获得了该抗菌肽的 N端序列; 通过 3′RACE技术获得其 3′端cDNA序列, 由此推导出其蛋白质 C端序列; 最终获得mytichitin-A的蛋白质全序列。mytichitin-A的理论分子量为 6273.37 D, 其质谱测试的精确分子量为 6261.55 D, 两者相差 12 D, 该结果表明mytichitin-A的6个半胱氨酸参与形成了3对二硫键,但其二硫键配对方式需进一步研究。目前已报道的贻贝抗菌肽均含有数目不等的半胱氨酸并形成多对二硫键, 例如, mytilin、myticin和MGD抗菌肽均含有8个半胱氨酸, 形成4对二硫键[15]; mytimycin含有12个半胱氨酸, 形成6对二硫键[19]; myticusin-1含有10个半胱氨酸, 形成5对二硫键[13]。从二硫键数目以及序列特征来看, mytichitin-A与上述贻贝抗菌肽具有明显差别, 是一种新型的贻贝抗菌肽分子。值得注意的是, Mytichitin-A的cDNA 序列所编码的前体蛋白序列长度为 446个氨基酸残基, 经signalIP4.1程序在线(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)分析, 其前体肽N端25个残基为典型的信号肽序列; 通过 NCBI的蛋白质数据库搜索发现mytichitin-A 的前体肽与数据库中的同源序列多为几丁质酶家族成员; 在抗菌肽数据库(http://aps. unmc.edu/AP/database)中进行搜索时, mytichitin-A成熟肽序列未能搜索到任何同源序列; 同时未发现有几丁质酶家族成员的蛋白质序列有经过剪切,其 C端部分独立具备抗菌肽活性的报道, 这表明mytichitin-A是一种新型的抗菌肽分子, 且其分泌机制与已知抗菌肽分子存在较大差异; 我们推测, mytichitin-A是其前体肽通过某种蛋白剪切机制, 其C端55个氨基酸残基所在肽段具备抗菌活性并分泌至血清中发挥免疫防御作用。但是, mytichitin-A的剪切是发生在性腺细胞内还是血淋巴中尚需进一步实验证实。同时, 经过结构域分析发现mytichitin-A的序列中所含几丁质结合结构域(Chitin binding peritrophin-A domain, pfam编号: pfam01607, 属于peritrophin-A家族类型 ), 该结构域通常含有6个半胱氨酸并形成 3对二硫键, 最早发现于昆虫肠道围食膜蛋白peritrophin[20,21]。几丁质结合结构域参与蛋白质和几丁质的结合。目前, 关于具有该结构域的抗菌肽分子报道并不多见, 少数已报道的具有几丁质结合结构域的抗菌肽分子主要来自甲壳类动物[22]以及苋属植物[23]。例如, 最早发现具有几丁质结合结构域的抗菌肽是 Kawabata et al.报道的, 来自马蹄蟹(Tachypleus tridentatus)血细胞的Tachycitin[24]。这是一种由 73个氨基酸残基构成的抗菌肽, 包含10个半胱氨酸并形成5对二硫键; Tachycitin的N端序列具有典型的几丁质结合结构域, 同时Tachycitin本身也具有几丁质结合的活性[24]; 此外, 从南美白对虾(Penaeus vannamei)中分离到的抗菌肽penaeidins(47—63个氨基酸组成, 含3对二硫键)也是一种具有几丁质结合结构域的抗菌肽分子, 既具有抗菌活性, 也具有几丁质结合活性[25]。上述具有几丁质结合结构域的抗菌肽分子均具有较强的抗真菌活性, 同时, 其几丁质结合活性推测可能与甲壳类动物体表的损伤修复有关。Mytichitin-A在体外抑菌试验中表现出明显的抑菌活性, 特别是对革兰氏阳性菌的活性较强, 同时对真菌也具有较强的抑制作用。但 mytichitin-A的几丁质结合结构域与其生物学功能之间的关联尚需进一步的实验证实。同时,对myticitin-1的三级结构预测结果表明, myticitin-1的空间结构以反平行β-折叠为主(图4); 而同样含有几丁质结合结构域的抗菌肽 Tachycitin的三维结构也以 5段反平行 β-折叠为主[26]。尽管 mytichitin-A与Tachycitin的序列相似性并不大(仅22%), 但两者的空间结构类似, 推测与两者具有类似的生物学活性有关。将 mytichitin-A 的 cDNA 序列经贻贝(Mytilus)的EST库搜索, 发现在加利福尼亚贻贝(M. californianus)、地中海贻贝(M. galloprovincialis)以及紫贻贝(M. edulis)的 EST 序列中均存在与mytichitin-A高度同源的EST序列(数据未展示); 综合上述结果, 作为一种新颖的抗菌肽分子, mytichitin类似的分子至少在贻贝属中广泛存在, 而且是一种在贻贝属中较为保守的抗菌肽分子。

值得注意的是, 多数水生生物的抗菌肽的表达部位通常位于皮肤[27]或者血细胞等相关组织。例如,贻贝抗菌肽的主要表达组织为其血细胞, 其中mytilin、myticin、MGD等抗菌肽均由贻贝血淋巴肿的颗粒细胞表达, 翻译后的抗菌肽分子或储存于血细胞, 或分泌至血淋巴中随着血液循环在全身各组织发挥防御作用[10]。而 Mytichitin-A主要在性腺组织表达。尽管 mytichitin-A抗菌肽是从贻贝血淋巴中通过分离纯化获得, 但是其基因表达量最高的组织是性腺(且在雄性和雌性贻贝个体中无明显表达差异), 其次是消化腺, 在性腺中的表达量较消化腺高出约150倍; 而血细胞中并未检测到mytichitin-A的表达。此外, mytichitin-A在性腺组织的表达受细菌诱导的影响, 在贻贝经灭活细菌诱导 12h后, mytichitin-A在性腺组织的表达量达到峰值, 其表达量较诱导前升高近9倍。在诱导24h后, mytichitin-A的表达恢复到本底水平。综合以上数据, mytichitin-A是一种主要由贻贝的性腺组织表达的, 含有几丁质结合结构域的新型抗菌肽分子, 其前体肽经酶解后, 成熟肽部分通过未知途径分泌入血, 由血液循环送至全身各个组织发挥抗菌活性。上述研究为进一步了解贻贝的免疫防御机制以及开发 mytichitin-A来源的生物抗生素奠定了基础。

致谢:

感谢湖南师范大学蛋白质化学研究室的胡卫军博士提供了质谱检测和蛋白质N端测序结果。

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A NOVEL ANTIMICROBIAL PEPTIDE IDENTIFIED FROM MYTILUS CORUSCUS

SUN Jing-Jing1, LIU Hui-Hui1, ZHOU Shi-Quan2, WANG Xin-Chao1, FAN Mei-Hua1, SHEN Wang1and LIAO Zhi1
(1. Laboratory of Marine Living and Molecular Engineering, College of Marine Science, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316004, China; 2. Joint Laboratory of Immunogenomics, Zhoushan Hospital-BIG/CAS, Zhoushan Hospital, Zhoushan 316004, China)

The researches on antibacterial peptides from Mytilus coruscus, an important mytilus on aquiculture, have significant value that helping people to understand the mechanism of innate immune system of this mussel. By using multi-dimensional reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), a novel antimicrobial peptide was isolated from Mytilus coruscus serum. The mass and the N-terminal sequence of this peptide were analyzed by a combination of Mass Spectrometry and Edman degradation. This peptide consisted 55 amino acids and had a 6621.55 D with 6 Cysteines presented in its sequence forming 3 disulfide bonds. A chitin-biding domain was detected by domain analysis and the peptide was named mytichitin-A therefore. The mRNA transcripts of mytichitin-A were mainly detected in gonad, which indicated that mytichitin-A were specifically synthesized and stored in genital system. The expression level of mytichitin-A in gonad was up-regulated and reached to the highest level at 12h after bacterial challenge, which was 9-fold increase compared to that of the control group. These results indicated that mytichitin-A was involved in the host immune response against bacterial infection and might contribute to the clearance of invading bacteria.

Mytilus coruscus; Antibacterial peptide; Chitin-biding domain; RT-PCR

Q936

A

1000-3207(2014)03-0563-08

10.7541/2014.79

2013-09-27;

2013-12-26

浙江省科技厅面上科研农业项目(2009C32016)资助

孙敬敬(1986—), 女, 山东济宁人; 硕士研究生; 主要研究方向为蛋白质结构与功能。E-mail: 451346219@qq.com

廖智(1973—), 男, 湖南长沙人; 博士; 主要研究方向为活性多肽的结构与功能。E-mail: liaozhi@zjou.edu.cn