单胺氧化酶A基因多态性与妊娠期高血压疾病的关系

孙燕 路春梅 侯雪晶

妊娠期高血压疾病(HDCP)是孕产妇和围生儿发病率及死亡率升高的主要原因之一。近年来越来越多的证据表明妊娠期高血压疾病与遗传学因素有着密切的关系［1］。研究表明，妊娠期高血压疾病患者血浆儿茶酚胺(CA)，尤其是去甲肾上腺素(NE)水平明显高于正常孕妇［2］，而单胺氧化酶A(MAO-A)主要分布在儿茶酚胺能神经元中，在妊娠期母体、胎盘、胎儿之间的单胺类神经递质转运的调节中发挥着重要的作用［3］，它是 CA 代谢过程中的主要降解酶，Cesura等［4］研究表明，MAO-A主要代谢NE和5-HT，其活性的高低影响CA的含量，MAO-A可能直接或间接地参与了妊娠期高血压疾病的发生。故MAO-A编码基因的多态性可能与妊娠期高血压疾病的发病有关。因此本研究采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCRRFLP)方法检测MAO-A基因EcoRV酶切位点(C/T)的基因型，并对该多态性与HDCP进行关联分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年6月至2013年7月在秦皇岛市第一医院产科住院并分娩的妊娠期高血压疾病患者共100例(病例组)，其中妊娠期高血压28例，轻度子痫前期26例，重度子线前期46例，平均年龄(26.13 ±3.23)岁;平均孕周(35.85 ±1.07)周。同期随机抽取在秦皇岛市第一医院产科门诊体检及住院的健康正常孕妇共90例，平均年龄(25.25±2.89)岁;平均孕周(37.81±0.85)周。2组孕妇均为河北籍汉族人，均为单胎、初产，均无高血压、心脏病、肾病、糖尿病及肝病等病史，均无输血史，无免疫性疾病及免疫治疗史。HDCP的诊断标准参照乐杰主编的第七版《妇产科学》中的标准。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA:受检者在知情同意后未进行处理前采集每位研究个体的静脉血1 ml，经枸橼酸钠抗凝后，采用 Tris-HCl饱和酚-氯仿 /异戊醇经典方法提取DNA。

1.2.2 PCR反应:查找基因库并参考文献后设计引物序列。引物由上海生物工程公司合成。上游引物为:5’-TTGACACTGATAGAATCTG-3’;下游引物为:5’-GATCACAAGGCTTTATTCTA-3’。PCR反应体系为50 μl，95℃预变性 5 min，然后 94℃变性 35 s、50℃退火40 s、72℃ 延伸 45 s，35 个循环后，72℃ 终末延伸4 min。取1%的琼脂糖凝胶对上述产物进行电泳鉴定，同时选择2 000 bp DNAmarker同时水平电泳，电泳结束后，取出凝胶，紫外仪下与DNA Marker跑出的条带相比较，同时判定扩增片段长度。

1.2.3 酶切:MAO-A基因EcoRV酶切位点的PCR产物的电泳条带为782 bp，PCR产物用EcoRV内切酶进行酶切，酶切体系为 20 μl，其中:灭菌去离子水7.3 μl、The Multi-core Buffer 2 μl、PCR 产物 10 μl、EcoRV 内切酶(10 U/μl)0.5 μl。于 37℃孵育箱中酶切14～16 h后，再经1%琼脂糖电泳鉴定MAO-A基因型。C/C基因型不可被酶切，电泳条带为782 bp，T/T基因型可被酶切为618 bp和164 bp两个片段，C/T基因型可被酶切为782、618和164 bp三个片段。见图1。

1.2.4 PCR产物基因测序:选择MAO-A基因EcoRV酶切位点的PCR扩增产物，随机挑取各基因型1例行基因测序，以此来进一步判断电泳所获基因型的正确与否。

图1 酶切后的电泳产物

1.3 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例组与对照组基因型频率和等位基因频率的比较 病例组和正常对照组的基因型分布都符合Hardy-Wein-berg平衡(P＞0.05)，说明群体基因遗传平衡。病例组MAO-A基因EcoRV酶切位点的C和T等位基因频率分别为70%、30%，与对照组MAO-A基因EcoR-V酶切位点的C和T等位基因频率68.9%、31.1%比较，差异无统计学意义(χ2=0.598，P=0.440)。病例组的C/C、C/T、T/T的基因型频率分别为50%、40%和10%，与对照组的C/C、C/T、T/T的基因型频率44.4%、42.2%和13.4%比较，差异无统计学意义(χ2=0.820，P=0.664)。见表1、2。

2.2 病例组妊娠期高血压、轻度及重度子痫前期各基因型分布情况 妊娠期高血压组中妊娠期高血压、轻度子痫前期、重度子痫前期间MAO-A基因型频率比较，差异无统计学意义(χ2=4.205，P=0.379)。见表3。

表1MAO-A等位基因分布情况 例(%)

表2MAO-A基因型分布情况 例(%)

表3 病例组妊娠期高血压、轻度及重度子痫前期各基因型分布情况例(%)

3 讨论

娠期高血压疾病是妊娠与血压升高并存的一组疾病，发病率约5% ～12%［4］。该疾病严重影响母婴健康，是孕产妇和围产儿病死率升高的主要原因。其发病原因至今不明。2001年随着众多国家公布了人类基因组图谱后，人类迈入了功能基因组学时代。个体基因组信息的获得将使疾病的分类或分型从以临床或病理为依据转向以个体的基因差异为依据。由于妊娠期高血压疾病具有较强的遗传倾向，因此基因变异或多态性可能是该病发病的重要原因，故MAO-A编码基因的多态性可能与妊娠期高血压疾病的发病有关。

单胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO，EC1.4.3.4)，全名为单胺:O2氧化还原酶，是机体内参与胺类物质代谢的主要酶类，它的主要功能是催化内源性和外源性单胺类物质的代谢，氧化脱氨产生过氧化氢。根据底物选择性和对抑制剂的灵敏度，单胺氧化酶被分为A(MAO-A)和B(MAO-B)两种，MAO-A主要分布在儿茶酚胺能神经元中，对底物血清素(5-HT)、NE、DA和抑制剂clorgylinc具有高亲和性。HDCP患者交感神经紧张性增加，血中CA尤其是NE水平增高，可能与HDCP的发病相关。MAO-A是CA代谢过程中的主要降解酶，其活性的高低影响CA的含量，CA的增高可能与MAO-A活性降低，CA的灭活减少有关，MAO-A可能直接或间接地参与了妊娠期高血压疾病的发生。由于妊娠期高血压疾病具有较强的遗传倾向，因此基因变异或多态性可能是该病发病的重要原因，故MAO-A编码基因的多态性可能与妊娠期高血压疾病的发病有关。EcoRV酶切位点位于MAO-A基因第14外显子上，由C、T两种等位基因构成。该多态性虽然没有改变该基因转录产物的碱基组成，但与细胞中MAO-A活性相关。其中T等位基因含EcoRV酶切位点，与MAO-A高酶活性相关联，而C等位基因不含EcoRV酶切位点，与MAO-A低酶活性相关联［优势比(odds ratio，OR;OR=6.0)］［5］。本研究测定了100例HDCP患者及90例健康对照组孕妇的MAO-A基因EcoRV酶切位点的基因型。测得HDCP组MAOA基因EcoRV酶切位点C/C、C/T、T/T各基因型的频率分别为:50%、40%和10%，对照组分别为:44.4%、42.2%和 13.4%，差异无统计学意义(χ2=0.820，P=0.664)。HDCP组MAO-A基因EcoRV酶切位点C、T等位基因的频率分别为:70%和30%，对照组分别为:68.9%和31.1%，差异无统计学意义(χ2=0.598，P=0.440)。病例组中妊娠期高血压、轻度子痫前期、重度子线前期C/C、C/T、T/T各基因型的频率分别为:50%、38.5%、56.5%;35.7%、46.2%、39.1% 和14.3%、15.3%、4.4%，差异无统计学意义(χ2=4.205，P=0.379)。说明MAO-A 基因EcoRV 酶切位点的多态性没有如预期的那样可能通过引起CA的升高，对妊娠期高血压疾病的发病起作用。虽然我们的研究显示MAO-A基因EcoRV酶切位点基因多态性与HDCP发病无相关性，等位基因C并没有增加妊娠期高血压疾病的发病风险。但是MAO-A基因有多个遗传多态性位点，本研究仅探讨了其中的一个多态性位点，MAO-A基因EcoRV酶切位点的多态性亦有可能与MAO-A的其他多态性位点连锁不平衡，影响CA的含量，而对HDCP的发病起作用。其次，不同种族和群体的遗传背景有差异，MAO-A基因EcoRV酶切位点的基因型在不同种族和群体中分布频率不一，因而我们不能断言MAO-A基因EcoRV酶切位点的多态性与HDCP的发病绝对无关。尚有待大样本多位点的综合分析来进一步探讨MAO-A基因EcoRV酶切位点的多态性与HDCP的关系。

1 Paula J.Williams and Fiona Broughton Pipkin.The genetics of pre-eclampsia and other hypertensive disorders of pregnancy.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2011，25:405-417.

2 Kaaja RJ，Leinonen A，Moore P，et al.Effect of changes in body posture on vasoactive homones in pre-eclamptic women.HUM Hypertens，2004，18:789-794.

3 Zhang H，Smith GN，Liu X，et al.Association of MAOA，5-HTT，and NET promoter polymorphisms with gene expression and protein activity in human placentas.Physiol.Genomics，2010，42:85-92.

4 Cesura AM，Pletscher A.The new generation of monoamine oxidase inhibitors.Prog Drug Res，1992，38:171-297.

5 Antoniou AN，Ford S，Pilley ES，et al.Interactions formed by individually expressed TAP1 and TAP2 polypeptide subunits.Immunology，2002，106:182-189.