CD117、Nestin、CD133和 Ki67在卵巢上皮性癌组织中的表达及意义

段爱红 孙志强 吴小华 杨丽萍 冯军玲

卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)占卵巢恶性肿瘤的90%，是生殖道恶性肿瘤中死亡率最高的疾病。EOC属于对化疗中-高度敏感肿瘤，目前的标准治疗是彻底的细胞减灭术和术后6～8个疗程的含铂类药物的联合化疗。常用铂类药物是顺铂(cisplatin，DDP)属重金属类化疗药物，与DNA结合形成双链交叉联接，形成DNA加合物。70%的患者停止化疗后逐渐复发，复发后的卵巢癌以化疗治疗为主，但多数病人呈现化疗耐药，晚期患者5年生存率长期徘徊在30%左右［1］。通常认为EOC起源于正常卵巢的表面上皮(normal ovarian surface epithelium，NOSE)，NOSE每月随卵子排出进行上皮的更新和修复，但其干细胞至今尚未分离鉴定［14］。EOC的治疗含多疗程化疗，通常采用间断的DDP最大可耐受剂量(maximum tolerated dose，MTD)方式。所以，复发肿瘤本身就是化疗药物选择后的瘤细胞群，以CSC繁殖形成的细胞为主。化疗药物的作用可导致敏感肿瘤死亡，并使残存肿瘤细胞的繁殖特性发生改变，理解化疗药物队敏感肿瘤细胞的杀伤效率和对残存肿瘤细胞的繁殖力的影响，对改善预后、延缓复发、提高肿瘤治疗效果意义重大。本课题通过免疫组化方法检测卵巢癌组织中 CD117，Nestin，CD133和Ki67的表达，探索其临床意义，结合临床资料加以分析，为卵巢癌的诊断、预后及治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 卵巢癌患者60例，所有患者术前均未接受放疗、化疗或激素治疗，初次手术方式为卵巢癌分期手术或肿瘤细胞减灭术，病理诊断确诊为上皮性卵巢癌，术后辅以铂类为基础的联合化疗。年龄31～66岁;其中浆液性腺癌25例，宫内膜样癌24例，粘液性腺癌11例。根据国际妇产科联盟(FIGO，2009年)［2］手术-病理分期:Ⅰ ～ Ⅱ期13例，Ⅲ ～ Ⅳ期 37例。组织分化程度低级别相当于FIGO高中分化(G1/G2)38例、高级别相当于低分化(G3)22例。参照2010年版 NCCN(national comprehensive cancer network)卵巢癌临床实践指南对铂耐药和铂敏感的定义，60例卵巢癌患者中19例铂耐药患者(即在初次接受含铂化疗停药6个月内出现复发)41例为铂敏感患者(即在初次接受含铂化疗停药6个月及以上出现复发)。20例卵巢正常组织来源:因子宫肌瘤等子宫良性病变行手术，术中取正常卵巢组织。

1.2 方法 采用免疫组化方法 S-P，检测 CD117、CD133及Nestin的表达，按试剂盒说明书操作。以PBS代替一抗为阴性对照，阳性对照片由福州迈新生物技术开发公司提供。生存期及标准:随访终止日期为2014年2月1日。总生存期(over all survival)指从手术确诊卵巢癌当日起至患者死亡日或随访终止日仍存活或失访的患者为统计学上的截尾数据(censored data)。

1.3 判断标准 CD117阳性细胞为胞膜或胞浆内出现棕黄色颗粒，Nestin阳性细胞为胞浆内出现棕黄色颗粒，CD133阳性细胞为胞核或胞浆内出现棕黄色颗粒，Ki67主要表达于细胞核中。判定标准［3］:无棕黄色颗粒为(－);染色弱、染色范围＞50%或染色强、染色范围25% ～50%者为(+);染色强，染色范围 ＞75%者为(+++);(+)和(+++)之间为(++)。

1.4 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件，计数资料采用χ2检验及Spearman检验，不同生存曲线的显著性用Log-rank统计学方法对数据进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD117、Nestin、CD133 和 Ki67 在卵巢癌及正常卵巢组织中的表达 CD117的染色阳性为胞膜内或胞浆内出现棕黄色颗粒，CD133阳性细胞为胞核或胞浆内出现棕黄色颗粒，Nestin的染色阳性为胞浆内出现棕黄色颗粒，Ki67主要表达于细胞核中。CD117、Nestin、CD133和Ki67在卵巢癌组织中的阳性表达率明显高于正常卵巢组织(P＜0.05)。见图1、表1。

图1 CD117，Nestin，CD133和Ki67在卵巢癌组织中的表达

表1 不同卵巢组织中CD117，Nestin，CD133和Ki67的表达例(%)

2.2 CD117、Nestin、CD133 和 Ki67 的表达与临床病理特征的关系 CD117、Nestin、CD133和Ki67在浆液性、粘液性、子宫内膜样卵巢癌中的阳性表达无统计学意义(P＞0.05)。在不同的卵巢癌组织分化程度中，低分化组CD117、Nestin、CD133表达的阳性率明显高于高中分化组，差异有统计学意义(P＜0.05);在FIGOⅠ期～Ⅱ期卵巢癌中CD117、Nestin、CD133表达的阳性率明显低于Ⅲ～Ⅳ期，两者相比有统计学意义(P＜0.05)，CD117、Nestin、CD133 在化疗耐药组的阳性表达率明显高于化疗敏感组，二者相比差异有统计学意义(P＜0.05)，Ki67在卵巢癌组织分化程度、残余病灶及CA125水平中阳性率差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 CD117、Nestin、CD133和Ki67表达与卵巢上皮性癌临床病理关系 例(%)

2.3 CD117、Nestin、CD133 的表达与卵巢癌患者生存率的关系 55例卵巢癌患者有详细的随访资料，5例失访，平均随访时间39个月。以CD117表达量的中位值(0.648)为界将卵巢癌患者分为高、低表达2组，绘制 Kaplan-Meier曲线，比较2组生存率的差异。Log-rank检验显示，CD117高表达组(＞0.648)患者生存率低，低表达组(＞0.648)患者生存率高，差异有统计学意义(P＜0.05)。同样方法，分析Nestin、CD133的表达与患者预后的关系，得到类似的结果(P＜0.05)。见图2 ～4。

图2 CD117在低表达和高表达组的生存曲线

图3 Nestin在低表达和高表达组的生存曲线

图4 CD133在低表达和高表达组的生存曲线

3 讨论

卵巢上皮性癌为女性生殖器官常见的恶性肿瘤，死亡率居各类妇科肿瘤之首，成为严重威胁妇女生命和健康的恶性肿瘤［4］。近年来随着对肿瘤生物学特性的研究进展，肿瘤干细胞理论越来越被重视，该理论认为肿瘤组织中存在一小群具有自我更新、无限增殖和多项分化潜能的肿瘤干细胞，这些特异性的细胞促使肿瘤的发生、发展和恶性转移。因此肿瘤干细胞的存在直接影响肿瘤治疗的敏感性和临床预后。由于对卵巢癌所起源的正常卵巢表面上皮中干细胞表型相关信息的缺乏，研究人员只能依靠已知的与卵巢表面上皮相关的干细胞标志物去鉴定及分离卵巢癌干细胞。目前，用于分离和鉴定卵巢癌干细胞较多的标志物有CD133、CD44/CD117、CD44/MYD88、Lgr5 和 ALDH1［5］。本研究选取其中的 CD117、Nestin 和 CD133作为肿瘤干细胞标志物，同时结合Ki67观察其在卵巢癌中的表达，探讨与卵巢癌的发生、发展和预后的关系。

CD117(又名c-kit)，原癌基因kit的受体，是造血干细胞的标志物，其表达异常可刺激肿瘤细胞的持续增殖和抗凋亡信号的失控，有利于肿瘤的恶性增殖［6］。在恶性黑色素瘤，肥大细胞性白血病，精元细胞瘤，胃肠道间质细胞瘤，乳腺癌等疾病的发生过程中均起到了非常重要的作用，作为肿瘤干细胞表面标志物越来越受到重视。

本研究发现卵巢癌中CD117的表达明显高于正常卵巢组织，而且随临床期别的增加CD117表达率也逐渐增加，提示CD117可能参与卵巢癌的发展过程，其可能的机制是由于CD117的过度激活，触发其下游信号途径的活化，最终诱导细胞的异常增殖、分化和抗凋亡信号的失控，从而导致了卵巢癌的发生。本研究同时探讨了CD117对于卵巢癌患者术后生存时间的影响，通过Kaplan-Meier生存曲线分析CD117高表达组患者生存率较低表达组生存率低(P＜0.05)，由此我们推测卵巢癌组织中CD117高表达的患者可能为化疗耐药型，生存率下降，影响预后;CD117低表达患者可能为化疗敏感型，生存率较CD117高表达组明显升高。这些结果为进一步深入研究卵巢癌干细胞表面标志物均有重要意义，对临床深入研究卵巢癌的靶向治疗可能有重要的参考价值。

Nestin是第Ⅵ类中间丝蛋白，目前被广泛应用于神经干细胞的鉴定，最新研究发现Nestin在多种恶性肿瘤细胞中表达，如恶性胶质瘤［7］，胃肠道间质肿瘤［8］，睾丸间质肿瘤［9］，恶性黑色素瘤［10］，Nestin 表达强度和肿瘤恶性程度和预后呈正相关。例如在黑色素瘤中，恶性度越高Nestin表达越强，在远处转移的肿瘤中Nestin表达更强;恶性度低的大脑胶质瘤Nestin表达强度远远低于恶性度高的。本研究应用免疫组织化学方法首次检测了Nestin在不同恶性程度卵巢癌中的表达。徐亮等［11］研究Nestin和CD133作为干细胞标志物在胶质瘤中的表达中显示:随着胶质瘤肿瘤级别增加，肿瘤标记物Nestin表达也增加，Kaplan-Meier生存曲线分析表明:Nestin高表达组患者生存率低，低表达组生存率高，表明Nestin表达越高，这与本研究结论一致。提示Nestin可作为判断卵巢癌恶性程度及预后的一种指标，Nestin表达越高，肿瘤组织中CSCs的数量越多，肿瘤的恶性程度就越高，在卵巢癌疾病发展过程中表现出耐药，其预后越差，生存率越低，从而预测肿瘤的恶性程度及患者的生存率，为卵巢癌的诊断和预后判断提供帮助。

CD133是一种细胞膜糖蛋白，由CD133/prom-1基因编码，目前是卵巢癌肿瘤干细胞最常见的标志物，是造血干细胞、多种正常组织和肿瘤干细胞的的标志物。

在卵巢癌的研究中，Ferrandina等［12］观察了CD133在正常卵巢组织、卵巢癌组织中的表达，结果显示原代卵巢癌CD133+CK7+细胞的克隆形成能力均高于CD133+CK7+细胞，而正常卵巢组织中CD133的表达显著低于卵巢癌组织。同时也有研究证实CD133+的卵巢癌肿瘤细胞与CD133－细胞比较具有较强的体内成瘤能力，且CD133+细胞对于化疗药物的敏感性显著低于CD133细胞［13］。本实验结果显示CD133在卵巢上皮性癌组织中的表达高于正常卵巢组织，提示CD133可能在肿瘤恶性表型的转化中发挥了重要作用。同时，我们进一步分析了CD133在卵巢上皮性癌中的表达，结果表明CD133蛋白的表达随着FIGO分期的进展而显著升高，提示CD133可能参与了卵巢癌的进展;低分化组的CD133蛋白的表达显著高于高分化组，即肿瘤组织学分级越高，分化越差，CD133蛋白的表达越高，提示检测CD133蛋白可能用于判断肿瘤的恶性程度。

综上所述，CD117、Nestin和CD133作为卵巢癌肿瘤干细胞标记物可能参与了卵巢癌的发生发展，其在不同分期卵巢癌中的差异性表达可作为评判肿瘤恶性程度的指标，利用CD117、Nestin和CD133在卵巢癌组织中的表达与肿瘤恶性程度病理级别及患者生存率之间的关系，可为临床提供诊治依据，联合监测Ki67可为预测卵巢癌疗效及预后的指标。

1 Ovarian cancer，five-year stage-specific relative survival rates(2004-2008).J Natl Cancer Inst，2011，103:1287.

2 丰有吉主编.妇产科学.第2版.北京:人民卫生出版社，2010.344.

3 张鸣号，彭亮，曹军，显微图像分析法与人工计数法在免疫组化结果判读中的应用.宁夏医科大学学报，2009，31:261-262.

4 Jemal A，Bray F，Center MM.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin，2011，61:69-90.

5 Bapat SA.Human ovarian cancer stem cells.Reproduction，2010，140:33-41.

6 Ali S.Role of c-kit/SCF in cause and treatment of gastronintestinal stomal tumors(GIST).Gene，2007，401:38-45.

7 Jin X，Jin X，Jung JE，et al.Cell surface Nestin is a biomarker for glioma stem cells.Biochem Biophys Res Commun，2013，19:496-501.［Epub ahead of print］

8 Enache S，Arsene D，Iosif C，et al.Nestin and caveolin-1 in the diagnosis of GISTs.Rom J Morphol Embryol，2012，53:41-46.

9 Ohnuma A，Yoshida T，Takahashi N，et al.Malignant Leydig cell tumor with spindle-shaped cells in a male CD-1 mouse.J Vet Med Sci，2010，72:661-664.

10 Akiyama M，Matsuda Y，Ishiwata T，et al.Inhibition of the stem cell marker nestin reduces tumor growth and invasion of malignant melanoma.J Invest Dermatol，2013，133:1384-1387.

11 徐亮，董军，兰青.干细胞标志物CD133和Nestin在不同恶性程度胶质瘤组织中的表达及其与预后的关系.中国神经肿瘤杂志，2009，7:175-179.

12 Ferrandina，G，Bonanno G，Picrclli L，et al.Expression of CD133-1 and CD133-2 in ovarian cancer.Int J Gynecol Cancer，2008，18:506-514.

13 Kryczek I，Liu S，Roh M，et al.Expression of aldehyde de-hydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells.Int J Cancer，2012，130:29-39.