三种不同IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞凋亡的影响

李雪平 董文辉 王智华 张征峥

细胞凋亡在肿瘤的发生、发展和转归中起重要作用，促进肿瘤细胞凋亡，是治疗肿瘤的手段之一。许多基因参与肿瘤凋亡。在以往研究中，我们发现不同IL-15基因转染可明显降低人小细胞肺癌细胞株NCIH446肿瘤细胞的增殖速率，但降低的程度彼此不尽一致［1］。IL-15基因转染是否也与肿瘤细胞凋亡有关，本文就其对NCI-H446细胞的凋亡及凋亡相关蛋白Fas表达做进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 野生型人小细胞肺癌细胞株NCIH446肿瘤细胞(Cw)，三种转染不同形式IL-15基因的NCI-H446细胞模型(转染原型IL-15基因的CIL-15、转染IL-15成熟肽基因的CIL-15mp和转染以IL-2信号肽替代IL-15信号肽的改型IL-15基因的CIL-2sp-IL-15mp)由河北医科大学免疫室提供［2］;G418、DMEM、和PI(碘化丙啶)为美国Sigma公司产品;FITC标记Fas抗体为美国BD公司生产，流式细胞仪为美国贝克曼公司Epics XL型。

1.2 细胞凋亡检测 分别取对数生长期的Cw、CIL-15、CIL-15mp和 CIL-2sp-IL-15mp细胞，2.5 g/L 胰蛋白酶消化后，预冷的PBS洗2次。分别取1×106个细胞，70%(V/V)酒精固定。上机前加入100 mg/L PI染液(含 500 mg/L Rnase)0.5 ml，闭光染色30 min，流式细胞仪检测，CXP软件分析结果。实验重复3次。

1.3 Fas蛋白检测 分别取对数生长期的Cw、CIL-15、CIL-15mp和 CIL-2sp-IL-15mp细胞，2.5 g/L 胰蛋白酶消化后，预冷的PBS洗2次。分别取1×106个细胞，每个样本加入FITC标记的抗人Fas抗体20 μl，避光15 min，离心2次，洗去未结合抗体，500 μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测，CXP软件分析结果。实验重复3次。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，分别进行多个样本均数间两两比较的方差分析和相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞凋亡率 四种细胞调亡率分别为:Cw(3.63±1.25)%、CIL-15(12.53 ± 2.18)%、CIL-15mp(17.97 ± 2.39)% 和 CIL-2sp-IL-15mp(29.30 ±4.19)%，4组间差异均有统计学意义(P＜0.05或＜0.01)。见图 1。

图1 细胞凋亡率

2.2 Fas蛋白表达 四种细胞Fas蛋白表达率分别为:Cw(19.87 ±3.23)%、CIL-15(29.90 ± 4.02)%、CIL-15mp(44.33 ±6.03)%和 CIL-2sp-IL-15mp(56.77±6.36)%，4组间差异均有统计学意义(P＜0.05或＜0.01)。见图2。

图2 Fas蛋白表达率

3 讨论

将有抗瘤作用的细胞因子基因转染肿瘤细胞，是肿瘤基因治疗的重要途径之一。研究表明IL-15具有抗肿瘤作用，且其抗瘤作用似于并且优于IL-2。用腺病毒载体将IL-15基因转染进鼠肺癌细胞株LLC(LLC/IL-15)中，接种到同基因鼠的肺组织中发现，肿瘤组织周围有大量的NK细胞浸润，说明LLC/IL-15细胞在同基因鼠体内激发了NK细胞的杀瘤活性［3］。由于IL-15mRNA的长信号肽影响IL-15蛋白的分泌，影响其抗瘤效果，有研究将改型的促分泌IL-15基因转染colon26肿瘤细胞，可以诱导CD8阳性细胞介导的肿瘤特异性免疫［4］。

许多基因转染可影响肿瘤细胞的凋亡，但有关IL-15基因转染对肿瘤细胞凋亡影响少有报道。我们将3种不同IL-15基因转染非小细胞肺癌肿瘤细胞株NCIH446，目的是观察原型、成熟肽及改型(IL-2信号肽替换IL-15信号肽)3种不同IL-15基因的抗瘤作用。

Fas属于TNF受体家族，Fas与FasL结合激发相关细胞的死亡信号，引发DNA断裂，致使细胞发生凋亡［5］;HAHNE等对黑色素瘤细胞研究发现，Fas表达与肿瘤的凋亡呈负相关，FasL表达与肿瘤的进展呈正相关［6］;一些细胞因子可以诱导不表达或低表达Fas抗原的肿瘤细胞表达或增量表达Fas蛋白［7］。

本研究结果显示，3种IL-15基因转染都可使NCI-H446肿瘤细胞凋亡率增加，但程度不同，细胞调亡率由高到低依次为 CIL-2sp-IL-15mp、CIL-15mp、CIL-15，表明不同IL-15基因转染可以促进NCI-H446肿瘤细胞凋亡，强度由强到弱依次为改型基因、成熟肽基因、原形基因，细胞凋亡率增加与3种不同IL-15基因转染致NCI-H446肿瘤细胞Fas蛋白表达水平的增加相一致。提示不同IL-15基因通过促进Fas表达，激发Fas与FasL结合，诱导NCI-H446肿瘤细胞凋亡。

1 王智华，王润田，丁军颖，等.不同IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞增殖的影响.免疫学杂志，2006，22:639-641.

2 张征峥，王润田，王 丽，等.三种不同IL-15基因转染NCI-H446细胞模型的建立与鉴定.免疫学杂志，2005，21:331-333.

3 Yoshimuta T.Gene therapy for murine Lung cancer using an adenoviral vector expressing Interleukin-15.Kurume Med J，2004，51:225-233.

4 Araki A，Hazama S，Yoshimura K，et al.Tumor Secreting high levels of IL-15 induces specific immunity to low immunogenic colon adenocarcinoma via CD8+T cells.Int J Mol Med，2004，14:571-576.

5 Kumar D，Zimpelmann J，Robertson S，et al.Tubular and interstitial cell apoptosis in the strep tozotoc in 2 diabetic rat kidney.Nephron Exp Nephrol，2004，96:77-88.

6 Hahne M，Rimoldi D，Schroter M，et al.Melanoma cell expression of Fas(Apo-1/CD95)ligand:implications for tumor immune escape.Science，1996，274:1363-1366.

7 Owen-Schaub LB，Radinsky R，Kruzel E，et al.Anti-Fas on nonhematopoietic tumors:levels of Fas/APO-1 and bcl-2 are not predictive of biological responsiveness.Cancer Res，1994，54:1580-1586.