天然抗癌药物紫杉醇的研究进展

吴秀兰，贾 艳，朱 波，周 杰

(正大天晴药业集团股份有限公司，江苏 南京 210023)

1 紫杉醇介绍

紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol) 被用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及Kaposi’s 肉瘤的治疗，同时也在研究与其他抗癌药物联用的治疗方法，是获得FDA批准的第一个来自天然植物的化学药物[1]。最初，紫杉醇是从短叶紫杉(Taxusbrevifolia)的树皮中分离获得，这种紫杉主要分布在北美西北太平洋区域从北加拿大到阿拉斯加的原生森林中。

短叶紫杉生长极其缓慢且不易繁殖，一棵直径22 cm、高度9 m的树大约有125年树龄，其树皮极薄，只有大约0.3～0.6 cm厚，这样的一棵树可以得到大约2 kg树皮。紫杉醇必须从新鲜砍伐剥取的树皮中提取。从砍伐树木，收集紫杉树皮到分离萃取出紫杉醇，消耗极大的人力物力财力。30吨干树皮可以得到大约100 g紫杉醇，花费大约150万美元。因为紫杉醇极难得到，所以在研究初期对紫杉醇的研究进度也极其缓慢。因此从植物中提取紫杉醇代价太高，而且会对生态环境造成破坏。迄今为止已经探索出化学半合成法、化学全合成法、植物细胞培养或内生菌培养等多种方法获得紫杉醇[1-3]。

2 紫杉醇的理化性质

紫杉醇为白色结晶性粉末，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。紫杉醇(C47H51NO14)(图1)基本骨架为三环二萜，具有高度官能团化的6-8-6-4四环结构和一个异丝氨酸侧链[4]。紫杉醇具有11个手性中心，其合成方法往往被化学家们公认为最具挑战性的任务之一。

图1 紫杉醇结构式

3 紫杉醇的来源

3.1 从植物中提取

紫杉醇最早在1966年被提取出来，当时主管北卡“研究三角学院”(research triangle institute，RTI)分馏实验室的化学家华尔(Monroe Wall)的研究小组采用400 根试管的逆流分配色谱法，从12 kg太平洋短叶红豆杉树皮中提取0.5 g紫杉醇，共历时2年，这种工艺十分繁琐，而且效率极低[5]。随着研究的不断深入，提取分离方法也在不断改进。目前比较成熟的方法为有机溶剂萃取法、固相萃取法和超临界流体萃取法。有机溶剂主要采用乙醇、甲醇或甲醇和二氯甲烷混合溶剂提取，提取效率高，方法简单，能耗少。Mattina等人[6]利用Empore固相萃取盘对甲醇粗提物进行提取，紫杉醇回收率为115.8%。近年来，超临界流体技术也被应用到紫杉醇的分离纯化过程中。Jennings等人[7]发现以乙醇为修饰剂的超临界CO2流体可以快速地从太平洋红豆杉树皮中提取出紫杉醇，收率较高。

3.2 化学全合成

由于紫杉醇具有复杂的手性中心，化学全合成方法的寻找成为了化学家们所面临的一个挑战。迄今为止已经有6个比较成熟的全合成方法。1997年，美国斯坦福大学Wender教授领导的研究小组完成了紫杉醇的第4条合成路线。Wender以马鞭烯酮为起始物，并采用直线法的合成战略。马鞭烯酮是大量存在于松树中的蒎烯在空气中的氧化产物，该化合物包括了紫杉醇20个骨架碳中的10个[8]。具体地说，包括了A环的6个骨架碳和B环关键的骨架碳。路线最显著的特点在于通过分子内的aldol反应完成了C环的构建，另外值得一提的是，Wender的路线是目前公开报道的较短的紫杉醇全合成路线。

1998年，日本的Kuwajima教授领导的研究小组公布了他们完成的紫杉醇合成路线。随后2000年他们又发布了在原合成路线上进行改进的路线，Kuwajima小组[9,10]采用的是汇聚式合成策略，分别合成A环片段和C环片段，随后，A环片段与C环片段连接构建关键中间体，并在此基础上完成环系上手性中心及官能团的构建，其中19位甲基立体选择性引入以及C3位手性中心的构建颇具特色。

同样在1998年，日本东京大学的Mukaiyama教授领导的研究小组完成了一条采用直线-汇聚联合策略的全合成路线，依次合成B环、BC环、ABC环、ABCD环[11]。路线中，通过不对称的aldol反应合成线性前体，再通过分子内的aldol环合构建八元环的反应很有特点。

3.3 半合成

所谓半合成，就是从可以再生的植物枝叶中提取本身并无活性的紫衫烷二萜类成分，并以之作为前体半合成紫杉醇，这也是缓解紫杉醇供应危机的可行手段之一。研究最多的是以巴卡亭III浆果赤霉素(baccatinIII)(图2)和10-去乙酰基巴卡亭III(10-脱乙酰基浆果赤霉素III,10-deacetybaccatinIII)为原料，通过选择性保护部分羟基，然后在C13羟基上接上合成侧链，再去掉保护基团得到紫杉醇[12]。从目前看来，半合成是最具有实用价值的制备方法，并且通过半合成研究可以获得有关紫杉醇类似物构效关系的信息，对紫杉醇进行结构改性以寻找活性更大、毒副作用小、抗癌谱有所不同或更广的抗癌药物。

图2 巴卡亭III

3.4 离体培养法

利用离体培养的红豆杉细胞或发根生产紫杉醇及其合成前体是紫杉醇来源的又一重要途径，它具有无污染、不破坏自然资源及不受自然条件的限制等优点。1989年，美国Christen等通过对太平洋红豆杉细胞培养生产出紫衫醇[13-14]。随后，日本、德国和韩国等也先后报道可以用细胞培养的方法产生高含量的紫杉醇。华东理工大学生物工程系对红豆杉细胞悬浮培养的细胞生长、蛋白质代谢、底物消耗及紫杉醇合成动力学进行了全面研究，在100L生物反应器中培养出红豆杉细胞，生长周期为20天左右紫杉醇含量达细胞干重的0.1%，比树皮中含量高10倍。梅兴国等还研究了两相培养系统中红豆杉细胞的生长与代谢规律，经过40天的培养，细胞生物量为17.85 g/L(干重)，紫杉醇的产量为30.19 mg/L[15]。这些研究为红豆杉悬浮细胞大规模培养生产紫杉醇实现产业化奠定了基础。

离体培养的另一途径是用发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogens)转化红豆杉细胞，诱导出发根，然后大量培养发根，再从发根中提取紫杉醇。由于发根生长速率快、遗传稳定以及具有正常根的分化结构稳定的特点，发根大量培养很可能成为生产紫杉醇的有效途径。盛长忠等利用土壤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)对东北红豆杉(Taxuscuspidate)不同外植体和不同生长期的愈伤组织进行了感染，结果表明，20 d的愈伤组织对该菌比较敏感，感染时间为5 min时，冠瘿诱导率较高(15.0%)，对在无激素B5培养基中得到的白色松软的冠瘿组织分析检测发现，有特异的胭脂碱(nopaline)存在，并具有产生紫杉醇的能力[16]。

3.5 内生菌法

Stierle等人[17]与1993年在Science上报道了通过紫杉树上分离出来的内生植物真菌(Taxomycesandreanae)来生产紫杉醇和相关的紫杉烷的研究结果，其紫杉醇的产量可达24～25 ng/L。研究人员通过大量的实验证明了所产生的化合物为紫杉醇，并且是由真菌生成的，并不是由植物或实验环境带入的。其中一个最有力的证据是用放射性乙酸盐进行饲喂实验，利用二维色谱检测产物的放射性斑点，与紫杉醇完全一致。随后，他们又从西藏红豆杉细枝中分离到一株内生真菌—小孢拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsismicrospora)，其发酵水平又比Taxomycesandreanae略高。因此推测，这可能是真菌偶然得到了一个紫杉树生物合成紫杉醇的基因造成的。此发现具有重大的科学意义和潜在的商业价值，但因表达量仍偏低，近期不可能实现商业化生产。

3.6 微生物转化法

利用生物酶类的高度选择性将紫杉醇结构类似的一些紫杉烷类化合物转化成紫杉醇的半合成前体，这样简化了分离过程并大大地提高了资源的利用率，为解决紫杉醇来源问题提供了一个很好的方法和思路。目前，紫杉醇类似物之间基因修饰以获得更高活性的新化合物应是一个更广阔的应用领域，近年来以紫杉烷类化合物为底物进行生物转化的研究获得了不少有意义的结果。

4 紫杉醇的生物合成途径

紫杉醇的生物合成途径目前已基本明了，其生物合成途径中多种酶的基因已经成功克隆。因此，随着生物技术的不断发展，通过微生物及酶法实现大规模生产紫杉醇及其类似物终将实现。

紫杉醇的生物合成途径大致分为3个主要阶段：①紫杉醇骨架的生物合成；②苯基异丝氨酸侧链的生物合成；③紫杉烷骨架和侧链的酯化反应，最终形成完整的紫杉醇分子。

4.1 紫杉醇骨架的生物合成

紫杉醇是萜类物质，根据生物次生代谢中酸类化合物的生源途径，紫杉醇的三环二萜骨架应由乙酰CoA开始，经某种代谢路径合成牻牛儿焦磷酸酯(geranyl geranyl diphosphate，GGPP)，再由GGPP环化形成碳环骨架，然后经一系列官能团化反应，最终形成紫杉醇[18]。

⑴ GGPP的生物合成。GGPP(图3)是二萜类化合物生物合成的共同前体，它是经焦磷酸异戊烯酯(isopentenyl dilphosphate，IPP)(图4)转变而来。关于GGPP的合成途径目前存在两种争论。

图3 GGPP 图4 IPP

①甲羟戊酸途径。由3个乙酰辅酶A(乙酰CoA)缩合生成3-羟基-3-甲基-戊二单酰辅酶A(HMG-CoA)，随后，在HMG-CoA还原酶(HMGR)的作用下，产生甲羟戊酸(MVA)。MVA再经焦磷酸化及脱羧脱水作用，形成C5的焦磷酸异戊烯酯(IPP)[19]，见图5。

图5 甲羟戊酸途径

②3-磷酸甘油醛/丙酮酸途径。Eisenreich等[20]利用核磁共振技术发现紫杉醇骨架结构的合成可能存在类似于真菌中的途径。这一途径与甲羟戊酸途径最大的不同之处就是所处的亚细胞位点不同，甲羟戊酸途径位于细胞质中，而3-磷酸甘油醛/丙酮酸途径位于质体中，两条途径作用的酶也有着重要区别，见图6。

图6 3-磷酸甘油醛-丙酮酸途径

⑵ 紫杉烷碳环骨架的生物合成。紫杉醇生物合成中第一步重要的反应是双烯前体GGPP环化形成紫杉-4(20)，11(12)-二烯(图7)。1995年，Ccroteau R等[21]将标记的GGPP加入到紫杉茎提取液中，进行放射化学方面的分离，通过二维NMR光谱证实，GGPP环化形成紫杉-4(5)，11(12)-二烯[taxa-4(5)，11(12)-diene](图8)。该反应是在紫杉二烯环化酶的作用下完成的，随后此二烯萜中间体进行不同程度的官能化，最后形成紫杉醇。

图7 紫杉-4(20)，11(12)-二烯

图8 紫杉-4(5)，11(12)-二烯

⑶ 紫杉烷碳环骨架的官能化反应。现知的第一步官能化反应是紫杉二烯的C5在细胞色素P450介导下的羟基化，形成紫杉-4(20)，11(12)-二烯-5α-醇[taxa-4(20)，11(12)-dien-5α-ol][22]，随后是酰基化，接着是C10位的羟基化，之后是一系列的细胞色素P450介导的羟基化和依赖于乙酰CoA的乙酰化反应，最后形成紫杉醇碳环骨架。

4.2 紫杉醇侧链的生物合成

苯丙氨酸是紫杉醇侧链合成的前体物质，Fleming等人[23-24]对苯丙氨酸的反应顺序进行了系统的研究。他们发现紫杉醇的侧链是由苯丙氨酸在氨基变位酶的作用下形成β苯丙氨酸，随后C2位发生羟基化反应生成苯基异丝氨酸，最后经过NH2基的酰基化而形成的。其苯甲酰部分与巴卡亭III结合生成去苯甲酰基紫杉醇，进而合成紫杉醇。

5 对紫杉醇研究的展望

由于全球环境的不断恶化，癌症的发病率越来越高，治疗癌症病人所消耗的紫杉醇将会越来越多。现阶段还无法大规模生产紫杉醇，导致紫杉醇价格昂贵，大多数病人无法支付其高昂的费用。如何将紫杉醇应用于大规模工业生产将会成为研究的重点领域，让紫杉醇更好地造福全人类，战胜肿瘤，促进人类健康事业的发展。

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