高效亲和色谱法测定牛初乳加钙咀嚼片中免疫球蛋白IgG的含量

邢俊波，曹 红，陈玉敏，水彩红，单婷婷，胡 丹，姜春来,靳守东

(中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所，北京 100071)

免疫球蛋白在人体特异性免疫及抗感染过程中起着重要作用，其抗感染能力与其在血清中的含量有直接关系。各种免疫球蛋白中IgG含量最高，约占血清总免疫球蛋白的75%～80%。IgG是血清和细胞外液中含量较高的免疫球蛋白,是再次免疫应答产生的主要抗体，能有效地预防相应的感染性疾病[1]。牛初乳加钙咀嚼片是以牛初乳粉和碳酸钙等为主要原料制成的保健食品，富含免疫球蛋白IgG、免疫促进剂等，从而增强儿童的自身免疫力，减少疾病感染机会，因此有必要对其主要功效成分IgG含量进行测定，提高其质量可控性。目前IgG检测方法主要有浊度法、免疫扩散法、紫外分光光度法和酶联免疫法等[2-3]，本文建立了采用高效亲和色谱柱测定牛初乳加钙咀嚼片中IgG的新方法。所建方法简便、快捷，专属性好，可用于其质量控制。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪：岛津LC-20AT高效液相色谱仪，SPD-20A紫外检测器，LC-solution色谱工作站。甲醇为色谱纯，水为重蒸水。免疫球蛋白IgG对照品(CFAD-I5006，上海安谱科学仪器有限公司)。牛初乳加钙咀嚼片(1.2 g/片×60片，批号为20120805、20120310、20130218，广东汤臣倍健生物科技股份有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：HI-Trap Protein G HP柱(1 mL)；流动相A: pH 6.5,0.05 mol/L磷酸缓冲液，流动相B: pH 2.5，0.05 mol/L甘氨酸盐酸缓冲液；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃。

表1 色谱条件

2.2 系统适用性试验

按上述色谱条件进样,得对照品、供试品及空白图谱，见图1，空白无干扰，理论板数按IgG峰计算可达8 000以上，且与相邻杂质峰的分离度均能达到要求。

2.3 供试品溶液的制备

取本品细粉约0.2 g，精密称定，置25 mL量瓶中，用0.05 mol/L磷酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，取上清液滤过，即得。

2.4 对照品溶液的制备

取免疫球蛋白IgG对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液。

2.5 阴性对照液的制备

按处方比例制备缺牛初乳的阴性样品，按含量测定方法操作，结果阴性样品在与免疫球蛋白IgG对照品相同保留时间处，未显示色谱峰。

2.6 线性关系的考察

精密吸取免疫球蛋白IgG对照品溶液(1.878 mg·mL-1)，0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL分别置于5 mL量瓶中，用0.05 mol/L磷酸缓冲液定容，摇匀。以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算得回归方程为：Y=62 994.12X-1 921.87，r=0.999 9，线性范围为：0.150 2～0.751 2 mg/mL。

2.7 样品溶液稳定性试验

将待测样品溶液，在室温下贮存，每间隔一定时间进样测定，平均峰面积为210 520，RSD为3.35%。

2.8 重复性试验

取同一批号的牛初乳加钙咀嚼片6份，按含量测定方法平行试验，测得平均含量为25.69 mg·g-1，RSD为0.76%。

2.9 准确度试验(加样回收率试验)

称取已知含量的同一批样品约0.10 g(6份)，精密称定，分别精密加入免疫球蛋白IgG对照品适量，按正文供试品溶液的制备方法操作，测定含量，并计算回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验

2.10 样品测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件，以外标法计算含量，结果3批制剂分别为25.69 mg·g-1、25.62 mg·g-1、25.85 mg·g-1。色谱图见图1。

A.对照品 B.样品 C.阴性 1.免疫球蛋白IgG

3 讨 论

高效液相亲和色谱兼具亲和色谱和高效液相色谱的特点，是一种特异性较好的分离技术，其将配基键合在凝胶柱上，先用磷酸盐缓冲液平衡柱，当进样后，活性免疫球蛋白IgG在磷酸盐缓冲液中与配基连接并吸附在凝胶柱上，再用甘氨酸-盐酸盐缓冲液将其洗脱。一般分析时间短，效率较高，操作也较简便。

高效亲和柱介质为结合protein G的琼脂糖，耐受的pH值范围窄，并且残余硅羟基可造成非特异吸附而降低收率，甚至导致失活，因此流动相pH值的控制是影响分离的关键因素，通过比较不同pH流动相后，确定最适流动相为pH6.5的磷酸盐缓冲液与pH2.5的甘氨酸-盐酸盐缓冲液。另外从对照品图谱上可看出IgG主峰前有其它杂质峰，可能是制备时含有其他杂蛋白所致，但不影响测定结果。

参考文献：

[1] 高永生，黄维星，时丽秀.不同年龄组血清中免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的含量特点[J].中国冶金工业医学杂志, 2012，29(5): 497-498.

[2] 王淼，薛巧如，姚敏菲，等.测定静脉注射人免疫球蛋白IgG含量的三种方法比较[J].解放军药学学报，2010，26 (6): 517-520.

[3] 项新华，尹香君，赵丹慧,等.酶联免疫双抗体夹心法检测牛初乳素中免疫球蛋白IgG[J].中国卫生检验杂志，2002，12(2)：137-138.