不同栽培年限伊贝母组织化学研究

张鹏葛，盛 萍，2*，安露莎，卢晓丽，王延蛟，徐海燕，2

(1.新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，新疆 乌鲁木齐830011；2.新疆医科大学 中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

伊贝母是《中华人民共和国药典》收载的、常用名贵大宗药材，为百合科植物新疆贝母FritillariawalujewiiRegel 或伊犁贝母FritillariapallidifloraSchrenk的干燥鳞茎。自1977年始收载在《中华人民共和国药典》历次版本中。性微寒，味苦，归肺、心经，具有清热润肺，化痰止咳之功效。临床上常用于肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳咳，咳痰带血等症[1]。在临床应有方面与药材川贝母相同，是中医处方和中成药生产常用的名贵药材。其野生品种仅分布在中国新疆境内[2-3]，为国家三级重点保护野生药材。由于野生伊贝母药材资源破坏严重，近年伊贝母作为我区道地药材的种植逐渐受到重视。研究表明，伊贝母主要药用成分为生物碱类和皂苷类成分[4]。目前，有关伊贝母总生物碱含量的动态变化、HPLC分析及药代动力学方面均有报道[5-6]，但涉及到药材质量和合理采收期与伊贝母药材体内总生物碱和总皂苷分布的组织结构及其相互间的关系方面未见报道，为此本文应用徒手切片法对伊贝母鳞茎的组织结构进行观察，同时运用组织化学方法研究总生物碱和总皂苷在不同栽培年限伊贝母鳞茎中的分布及其含量差异，为指导人工栽培和确定伊贝母最佳采收期，及合理开发利用和保护伊贝母药材资源提供科学依据。

1 仪器与材料

Mikroskop Primo Star X2005型数码显微镜，供试材料为不同栽培年限伊贝母药材，经新疆医科大学中医学院盛萍教授鉴定为百合科植物新疆贝母FritillariawalujewiiRegel或伊犁贝母FritillariapallidifloraSchrenk的干燥鳞茎。凭证标本存放于新疆医科大学中医学院中药资源教研室。新疆贝母FritillariawalujewiiRegel按不同栽培年限(3年、4年、5年)以W1、W2、W3表示；伊犁贝母FritillariapallidifloraSchrenk按不同栽培年限(3年、4年、5年)以P1、P2、P3表示，伊贝母药材样品信息见表1。

表1 不同栽培年限伊贝母药材信息表

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 植物解剖学方法

对实验材料采用徒手切片方法，在Mikroskop Primo Star X2005型数码显微镜下观察并记录药材显微组织结构特征。

2.1.2 生物碱组织化学方法

对实验材料采用徒手切片方法，并放置于载玻片上直接滴加改良碘化铋钾试剂[7](0.85 g碱式硝酸秘溶于10 mL冰醋酸和40 mL蒸馏水后，再与20 mL 40%的碘化钾溶液混合而成)染色60～150 s，产生生物碱沉淀，在Mikroskop Primo Star X2005型数码显微镜下观察并拍照，以只加稀甘油处理的切片为对照组。对不同栽培年限伊贝母药材中总生物碱的粗略定性量化测定：各取6张不连续的切片进行比较观察，每张切片观察4个视野，根据生物碱黄色沉淀颗粒的分布密度及大小，划分为5个等级：+++++级，颗粒的分布密度密、颗粒大；++++级，颗粒的分布密度中等、颗粒大或颗粒的分布密度密、颗粒中等；+++级，颗粒的分布密度中等、颗粒中或颗粒的分布密度密、颗粒小或颗粒的分布密度稀、颗粒大；++级，颗粒的分布密度稀、颗粒中等；+级，颗粒的分布密度稀、颗粒小或无。

2.1.3 皂苷组织化学方法

对实验材料进行徒手切片，并放置于载玻片上直接滴加等量的5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合试剂[8](1g香草醛溶于20 mL冰醋酸，再与等量的高氯酸混合而成)，染色2 min后，在Mikroskop Primo Star X2005型数码显微镜下观察并拍照，以只加稀甘油处理的切片为对照组。对不同栽培年限伊贝母药材中总皂苷的粗略定性量化测定：各取6张不连续的切片进行比较观察，每张切片观察4个视野，根据总皂苷与皂苷显色剂反应颜色的深浅，划分为5个等级：+++++级，深紫色；++++级，紫红色；+++级，红色；++级，淡红色；+级，颜色浅或无。

2.2 结果

2.2.1 伊贝母横切面组织结构特征

伊贝母两种法定基源植物的鳞茎主要是由表皮，皮层薄壁组织，有限外韧型维管束组成，含有大量淀粉粒及少量单细胞非腺毛，单细胞非腺毛长40～210 μm。表皮细胞类长方形，排列较紧密，偶见气孔。薄壁组织细胞类椭圆形或多角形，排列较疏松，其上分布有大量淀粉粒。淀粉粒多为单粒，为广卵形、类球形、长圆形、椭圆形。大小差异较大，直径为 5～40 μm，少见复粒，复粒由2～4个单粒组成，观察结果同文献[9]的结果相一致。维管束中导管多为螺纹导管。不同栽培年限的伊贝母维管束数目不同：3年、4年和5年生的新疆贝母的维管束数目依次为：40～42束、44～48束、52～56束，每个维管束中螺纹导管的数目逐年无明显变化，多为3～5个；3年、4年和5年生的伊犁贝母的维管束逐年无明显变化，多为30～33束，每个维管束中螺纹导管的数目不同，依次为：2～4个、4～6个、5～7个。

2.2.2 生物碱组织化学分布情况

对伊贝母鳞茎的徒手切片进行碘化铋钾沉淀反应后，可观察到在伊贝母鳞茎的薄壁组织细胞的细胞壁和维管束周围的薄壁组织细胞中含有较多的黄色——深黄色生物碱沉淀，表皮细胞上有较少分布(图1)。随着栽培年限的增加，新疆贝母鳞茎中的生物碱沉淀物逐年减少，栽培3年和4年的新疆贝母鳞茎中总生物碱含量较高(图1：3-8)；伊犁贝母鳞茎中的生物碱沉淀也随着栽培年限的增加，而逐年减少，栽培3年和4年的伊犁贝母鳞茎中总生物碱含量较高(图1：9-14)。对伊贝母鳞茎的生物碱沉淀反应进行量化表明，伊贝母鳞茎中生物碱沉淀在不同显微组织结构部位、不同栽培年限、不同种间存在量上的变化(表2)。

图1 不同栽培年限伊贝母总生物碱组织化学定位

2.2.3 皂苷组织化学分布情况

对伊贝母鳞茎的徒手切片进行5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合试剂处理后，可观察到在伊贝母鳞茎的表皮细胞和维管束周围的薄壁组织细胞中按皂苷含量由少至多，呈现出淡红—红—紫红—深紫的颜色变化，而薄壁组织细胞内皂苷含量缺乏(图2)。随着栽培年限的增加，新疆贝母鳞茎中的皂苷反应颜色逐年变深，栽培5年和4年的新疆贝母鳞茎中总皂苷含量较高(图2：3-8)；伊犁贝母鳞茎中的皂苷反应颜色也随着栽培年限的增加，而逐年变深，栽培5年和4年的伊犁贝母鳞茎中总皂苷含量较高(图2：9-14)。对伊贝母鳞茎的皂苷反应颜色进行量化表明，伊贝母鳞茎中皂苷在不同显微组织结构部位、不同栽培年限、不同种间存在量上的变化(表2)。

表2 不同栽培年限伊贝母组织结构中生物碱和皂苷的分布及其含量的比较

图2 不同栽培年限伊贝母总皂苷组织化学定位

续表2

3 讨 论

3.1 伊贝母横切面组织结构特征

新疆贝母和伊犁贝母鳞茎的显微组织结构基本相同，新疆贝母的维管束数目略大于伊犁贝母，新疆贝母随着栽培年限的增加其维管束的个数也逐年增长，但维管束中的导管数没有明显增长；伊犁贝母随着栽培年限的增加其维管束的个数没有明显增长，但维管束中的导管数却有相应的增长。随着栽培年限的增长，新疆贝母和伊犁贝母鳞茎中总的导管数逐年增长，从而可以把根部吸收的水和无机盐输送到植株身体各处，以满足伊贝母随着栽培年限的增长所需要营养物质的增加量。

3.2 伊贝母中生物碱分布特点

在文献[10]中，对生物碱显色剂进行了比较和确立，发现碘化铋钾试剂处理观察生物碱较为理想，因此本实验中直接采用碘化铋钾试剂作为生物碱显色剂，生物碱同碘化铋钾试剂能生成黄色到深黄色的不定型沉淀(低倍镜下呈小黑点)。伊贝母鳞茎中的生物碱主要分布于薄壁组织细胞的细胞壁及维管束周围薄壁组织细胞中，而表皮细胞上有较少分布，研究结果同文献[10]报道相一致。因此，在选择栽培品种及年限时，选择薄壁组织和维管束周围薄壁组织占鳞茎横切面百分比大的药材，并且在栽培时，可以采取一些增加生物碱含量的栽培措施，从而提高药材质量。从表2可知，不同栽培年限伊贝母药材中生物碱含量由高到低的顺序为：3年生的伊贝母≥4年生的伊贝母?5年生的伊贝母，结果同文献[11]中一致。相同栽培年限的新疆贝母总生物碱含量略低于伊犁贝母，这可能与伊犁贝母比新疆贝母形状大有一定关系，以生物碱含量为选择栽培年限作为指标，可推断3年生和4年生为伊贝母最佳栽培年限。

3.3 伊贝母中皂苷分布特点

对伊贝母鳞茎总皂苷的组织化学定位研究表明：伊贝母药材中总皂苷与皂苷显色剂发生反应，呈现出淡红—红—紫红—深紫的颜色变化。表皮细胞和维管束周围薄壁组织细胞中皂苷含量比薄壁组织细胞中皂苷含量多，从表2可知，不同栽培年限伊贝母药材中皂苷含量由高到低的顺序为：5年生的伊贝母≥4年生的伊贝母>3年生的伊贝母，而相同栽培年限的新疆贝母总皂苷含量明显高于伊犁贝母。以皂苷含量为选择栽培年限作为指标，可推断4年和5年生为伊贝母最佳栽培年限。

根据伊贝母不同栽培年限中总生物碱和总皂苷含量动态变化分析，伊贝母中总生物碱和总皂苷有效成分含量均较高时，推断第4年应为最佳采收期。值得提出的是我们观察生物碱和皂苷分布的研究结果与课题组进行的不同栽培年限伊贝母总生物碱含量测定的研究结果完全吻合。

在文献[12]中研究表示贝母中生物碱同淀粉粒有一定关系，而在本实验中，不同栽培年限伊贝母总生物碱和总皂苷含量的动态变化中，可观察到：在不同组织结构、栽培年限、种间中随着总生物碱含量增加而总皂苷含量相应减小。因此，皂苷、生物碱、淀粉粒这三者的关系在伊贝母中还有待进一步的研究。

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