超声波提取-树脂纯化多穗柯叶中甜味剂的工艺研究

2014-03-29李爱民李胜华伍贤进

中国野生植物资源 2014年5期

李爱民，李胜华，张元，刘英，李斌，伍贤进*

(1.怀化学院民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室,湖南怀化418008;2.怀化学院湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室生命科学系，湖南怀化418008)

多穗柯[Lithocarpuslitseifolius(Hance) Chun]为壳斗科(Fagaceae)柯属常绿植物[1]，因其叶浸泡后具有很高的甜味，而被称为甜茶。多穗柯多以野生状态分布于长江以南各省区，其中湖南、福建、江西、广西、安徽等省资源丰富且集中，湖南以雪峰山一带分布较多。据《全国中草药汇编》等记载：多穗柯茶能防治高血压、治疗湿热痢疾、皮肤瘙痒、痈疽恶疮等症，而且具有滋养肝肾、和胃降逆、润肺止咳、解困醒酒等功效[2-3]。另外，甜茶在抗炎、镇痛、调节免疫、增强抗应激能力、改善微循环、抗心肌缺血、降血脂、抗脂肪肝、抗Ⅱ型糖尿病及糖尿病并发症、协同增进抗肿瘤药物疗效等药理方面也有作用[4-7]。研究发现多穗柯叶所含的甜味剂，主要成分是根皮苷和二氢查耳酮[8-10]，甜度为蔗糖的300倍，而且其毒性较低，安全范围较广，与蔗糖混用效果更好[11]。因此，研究多穗柯中所含甜味剂的提取分离及纯化技术，具有重要的理论及实践意义。

大孔树脂分离技术是近年来发展起来的新型分离纯化技术，具有物理稳定性高、吸附选择性好、再生简便、解吸条件温和、使用周期长等优点，而广泛应用于植物天然产物的分离纯化。利用大孔树脂分离黄酮类物质已有不少报道[12-15]。多穗柯作为一种天然的糖类植物，其甜味剂的研究还比较少，目前多是对多穗柯中总黄酮[16]或单一成分[17-19]进行纯化、测定，不利于多穗柯甜茶及其他产品质量标准的制定。本文利用超声波提取法和大孔树脂纯化法对多穗柯叶中甜味剂的主要成分根皮甙和新橙皮苷二氢查尔酮的提取及纯化工艺进行了系统研究，旨在获得提取及纯化多穗柯叶中甜味剂的最佳工艺，为规模化利用多穗柯叶的甜味剂及其质量评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

多穗柯叶采集于湖南芷江县，经伍贤进教授鉴定为壳斗科植物多穗柯[Lithocarpuslitseifolius(Hance) Chun]的叶。

1.2 试剂与仪器

AB-8型大孔树脂(天津海光化工有限公司)；根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮(NHDC)对照品(>99%) (Sigma公司)；色谱甲醇(天津科密欧化学试剂有限公司)；纯净水(怀化娃哈哈恒枫饮料有限公司)；乙醇、盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钠等均为分析纯。

CTXNW-10B超声波循环提取仪(北京弘祥隆生物技术开发有限公司)；RE-210型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津生物仪器有限公司)；AL104电子天平(美国Mettler-Toledo仪器公司)；CTXNW-10B超声波循环提取仪(北京弘祥隆仪器有限公司)；OSB-2000旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；202-3A型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；KQ2200DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 多穗柯甜味剂的提取

准确称取多穗柯粉末2.00 g，按固液比例加入乙醇溶液，对其进行超声波辅助提取，乙醇浸泡24 h后，抽滤，将滤液旋转蒸发后用色谱甲醇洗脱至100 mL容量瓶，定溶得待测样品液备用。

1.3.2 甜味剂含量测定

1.3.2.1 色谱条件

色谱柱：WondasilTMC18柱；流动相：A泵为1% mol/L的NaH2PO4溶液，B泵为甲醇；流速：1 mL/min；检测波长：283 nm；进样体积：20 μL。

1.3.2.2 标准曲线的绘制

准确称取在80 ℃下干燥至恒重的根皮苷标准品10.00 mg，新橙皮苷二氢查尔酮(NHDC)标准品5.00 mg，混合后用色谱甲醇溶解，定容至25 mL，即得0.40 mg/mL根皮苷与0.20 mg/mL NHDC的标准溶液。分别吸取标准溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于5支25 mL定量管中，用色谱甲醇定容至刻度线，混匀放置15 min。HPLC在283 nm处测定各定量管中溶液的峰面积。重复3组，取平均值。以根皮苷浓度为横坐标，峰面积为纵坐标得标准曲线：y=2 510 027 445.00x+23 157.51，R=0.999 9；以NHDC浓度为横坐标，峰面积为纵坐标得标准曲线：y=5 850 158 256.25x+9 414.97，R=0.999 9。二者在0.002～0.008 mg/mL的范围内均呈良好的线性关系。

1.3.2.3 样品中甜味剂含量的测定

取经1.2.1步骤制得的样品液10 mL置于10 mL定量管中过滤，精密量取滤液20 μL进样，按标准品同样的色谱条件测定，记录40 min样品图，计算甜味剂的含量和得率。

甜味剂得率(%)= 样品中甜味剂含量×样品溶液体积/样品干重×100%。

1.3.3 超声波提取单因素实验

1.3.3.1 乙醇浓度的选择

分别用50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液50 mL浸泡2.0 g的样品，在600 W功率下超声波提取45 min，按1.2.2方法测定HPLC波峰面积，计算根皮苷和NHDC含量。

1.3.3.2 固液比的选择

用70%的乙醇，使固液比分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，在600 W功率下超声波提取45 min，按1.2.2方法测定HPLC波峰面积，计算根皮苷和NHDC含量。

1.3.3.3 超声波萃取时间的选择

在固液比1∶25，70%乙醇条件下选择时间分别为25 min、35 min、45 min、55 min、65 min进行超声波提取(600 W)，按1.2.2方法测定HPLC波峰面积，计算根皮苷和NHDC含量。

1.3.4 大孔树脂纯化甜味剂

1.3.4.1 大孔树脂的处理

将AB-8型大孔树脂使用前用2倍体积的5%的氢氧化钠水溶液浸泡12 h，再用水冲洗至排除液为中性。然后用1 mol/L盐酸浸泡12 h，之后用水冲洗去至中性。再用无水乙醇浸泡12 h，再用水洗至中性。最后用蒸馏水水养。

1.3.4.2 吸附与解析单因素实验

(1)乙醇浓度对解析的影响。对5份相同的样品液在相同流速和相同的吸附柱上进行吸附，分别在50%、60%、70%、80%、90%乙醇的条件下进行洗脱，洗脱完后，减压浓缩回收乙醇，色谱甲醇定容，用高效液相色谱法测定根皮苷和NHDC的含量。

(2)洗脱液体积对解析的影响。对5份相同的样品液，相同条件下，分别在0.625 BV、1.25 BV、1.875 BV、2.5 BV、3.125 BV的条件下进行洗脱，收集洗脱液，旋转蒸干，色谱甲醇定容，用高效液相色谱法测定根皮苷和NHDC的含量。

(3)洗脱流速对解析的影响。对5份相同的样品液，相同条件下，分别在1 mL/min、1.5 mL/min、2 mL/min、2.5 mL/min、3 mL/min的条件下进行洗脱，收集洗脱液，旋转蒸干，色谱甲醇定容，用高效液相色谱法测定根皮苷和NHDC的含量。

(4)吸附流速对吸附的影响。对5份相同的样品液，在相同流速和相同的吸附柱上进行吸附，分别在1 mL/min、1.5 mL/min、2 mL/min、2.5 mL/min、3 mL/min的条件下进行吸附实验，用高效液相色谱法测定其洗脱液中根皮苷和NHDC的含量。

1.3.5 正交试验优化纯化条件

以多穗柯中根皮苷和NHDC的纯度作为考察指标，对乙醇浓度、洗脱剂体积、洗脱剂流速、吸附流速4个因素进行优选。每个因素设3个水平，采用L9(34)正交设计，考察因素设计见表1。

表1 正交实验因素表

1.3.6 甜味剂纯度计算

洗脱液旋转浓缩后冷冻干燥至恒重得甜味剂精制品，准确称取一定质量(m1)mg样品，用适量甲醇溶解定容后，按1.2.2方法分别测定根皮苷和NHDC含量(m2)mg，计算样品纯度：

纯度(%)=m2/m1×100%

2 结果与分析

2.1 HPLC图谱的建立

按照1.2.2色谱条件分别建立对照品的HPLC图和样品HPLC色谱图，图谱见下图(图1和图2)，从图可以看出，样品在此条件下分离效果较好。

图1 根皮苷和NHDC混合标准品色谱图

图2 多穗柯样品溶液HPLC图

2.2 单因素实验结果及分析

2.2.1 乙醇浓度对根皮苷、新橙皮苷二氢查尔酮提取的影响

图3表明：当乙醇浓度的增加时，根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的提取率也逐渐增加，但是当乙醇浓度超过70%的时候，根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的提取率随乙醇浓度增加反而略有降低，原因可能是乙醇浓度的增大，使样品中粗提杂质含量增加，因而有效成分相对含量降低，从而影响提取物有效含量。

图3 乙醇浓度对提取根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的影响

2.2.2 固液比对多穗柯根皮苷、新橙皮苷二氢查尔酮提取的影响

浸提固液比在1∶15至1∶25的范围内，根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的提取率是随着固液比的增加而不断上升的，且浸提固液比在1∶25时提取率最高，但随后增加溶剂的量增加而提取率基本变化不大。而在实际操作中，当浸提固液比过大时，旋转蒸发转移溶剂时耗时长耗能多，因此选择浸提固液比在1∶25较为合适。

图4 固液比对提取根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的影响

2.2.3 超声波提取时间对根皮苷、新橙皮苷二氢查尔酮提取的影响

随超声波提取时间从25 min到65 min，根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的提取率是不断升高的，但提取时间从35 min后有所下降。超声波提取时间再增加，提取得率将呈现平稳甚至略有下降的趋势。造成这种情况的原因可能是在长时间超声作用下，提取率逐渐向极限值靠近，致使提取得率增幅降低。同时超声作用时间太长，会使提取粗品中杂质含量增加，有效成分含量反而降低，影响提取物有效含量。

图5 超声波提取时间对提取根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的影响

2.3 吸附与解析单因素实验

2.3.1 不同浓度乙醇对洗脱效果的影响

在其他条件不变的情况下，用不同浓度的乙醇进行洗脱，结果见图6。由图6可知，随着乙醇浓度的增高，洗脱液中根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮纯度随着乙醇浓度的增高而增高，当乙醇浓度超过80%之后，洗脱液中根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮纯度随着乙醇浓度的增高而降低。究其原因，可能是一些醇溶性物质溶出量增加，导致根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮纯度降低。因此，最佳乙醇浓度确定为80%左右。

图6 乙醇浓度对纯化根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的影响

2.3.2 洗脱液不同体积对纯化效果的影响

其他条件不变，改变洗脱液体积，所得根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮纯度结果见图7。由图7可知，随着洗脱液体积的增加，根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的纯度逐渐增高，达到最高峰后缓慢下降。这是因为用洗脱液体积太小，吸附在树脂上的根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮不能完全被洗脱下，从而使得洗脱液中含量较低。在1.25 BV时，根皮苷和二氢查耳酮纯度达到最大。因此，最佳的乙醇洗脱体积确定为1.25 BV左右。

图7 洗脱液体积对纯化根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的影响

2.3.3 洗脱液不同流速对纯化效果的影响

其他条件不变，改变洗脱液流速，结果见图8。由图8可知，随着洗脱液流速的增加，洗脱液中根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮纯度逐渐下降。这是由于洗脱液流速增大时，与树脂的接触时间相对要减小，从而使树脂上的根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮不能很好的被洗脱下来。当洗脱流速在1 mL/min时，根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮纯度相对最大，当洗脱流速在3 mL/min时，纯度相对最小。因此，本实验乙醇洗脱流速确定为1 mL/min左右。

2.3.4 吸附流速对吸附的影响

其他条件不变，改变吸附流速，结果见图9。从图9可以看出，随着吸附流速的增高，洗脱液中根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的纯度越高，意味着二者被吸附的量越少。当吸附流速为1 mL/min时，在洗脱液中根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮含量最小，被树脂吸附的量最多，吸附效果最好。因此，最佳洗脱液流速应不超过1 mL/min。

图8 洗脱剂流速对纯化根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的影响

图9 吸附流速对纯化根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的影响

2.3.5 正交实验设计结果

以多穗柯中根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的纯度作为考察指标，实验结果及方差分析见表2和表3。

表2 正交实验结果

续表2

表3 正交实验结果的方差分析

通过综合比较各因素的极差值(R)可以看出，乙醇浓度(A)、洗脱剂体积(B)、洗脱剂流速(C)、吸附速度(D)这4个因素对纯化根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的影响是不同的。对于纯化根皮苷来说，影响因素大小顺序为B>A>C>D，最佳组合为A3B3C3D3；对于纯化新橙皮苷二氢查尔酮来说，影响因素大小顺序为B>A>D>C，最佳组合为A3B3C3D3。由方差分析可知，乙醇浓度(A)、洗脱剂体积(B)、洗脱剂流速(C)、吸附速度(D)这4个因素对纯化根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的影响均没有显著性差异。由于乙醇浓度(A)、洗脱剂体积(B)对纯化效果的影响要大于洗脱剂流速(C)、吸附速度(D)对纯化效果的影响，考虑单因素实验的结果，对洗脱剂流速(C)、吸附速度(D)进行了调整，得到纯化这两种物质的最佳组合为A3B3C2D1，即最佳工艺条件为：乙醇浓度：90%、洗脱液体积：1.875 BV、洗脱剂流速：1 mL/min、吸附流速：0.5 mL/min。按照最佳条件进行3次重复实验，结果根皮苷的平均纯度为88.616%，新橙皮苷二氢查尔酮的平均纯度为71.8226%。与正交试验最大值接近，说明方法可行。

3 结论与讨论

采用HPLC检测分析根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮纯度，获得了超声波提取、AB-8树脂纯化多穗柯叶中甜味剂的最佳工艺条件。该方法简单易行，快速高效，精确度高，设备简单，为多穗柯甜味剂的工业化提取提供了依据。曾有报道[20]比较了水提法和乙醇回流法从多穗柯叶中提取总黄酮类化合物的最佳条件，认为用25倍量80%乙醇回流2 h，能得到总黄酮类物质含量为12.59%。李胜华等[16]用超声波辅助提取多穗柯叶中的总黄酮，以原料35倍量的70% 乙醇作为溶剂，在提取功率600 W、提取时间15 min 的条件下，即可获得多穗柯总黄酮最佳提取效果，提取时间大大缩短。我们用超声波提取根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮，提取时间也仅需35 min，相对于于丽静等[21]80 ℃水浸提60 min来提取二氢查耳酮的工艺，也要节省时间。可见采用超声波辅助提取比传统的提取工艺省时，与微波提取时间几乎相当[22]。超声波提取不同的植物有效成分结果不同，即使是提取同一植物有效成分，也会因参数的变化而得到不同的实验结果。本方法乙醇为溶剂，超声波提取，提取工艺非常简单，条件容易控制，提取率高。乙醇易除净，对人体基本无毒害作用，因此项目具有很好的开发前景。

本实验通过单因素实验和L9(34)正交实验设计得出根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮的最佳分离纯化工艺为：乙醇浓度：90%、洗脱剂体积：1.875 BV、洗脱剂流速：1 mL/min、吸附流速：0.5 mL/min。通过3次验证实验，根皮苷的平均纯度为88.616%，新橙皮苷二氢查尔酮的平均纯度为71.823%。通过方差分析表明洗脱剂体积对工艺的影响较其他显著。由于根皮苷和二氢查耳酮是两种不同的物质，所以不同的条件对其分离纯化效果的影响不同。

在本实验中，选择乙醇作为洗脱剂，不仅较其他有机溶剂经济，而且乙醇毒性小，安全，对黄酮类物质有较好的溶解效果，易挥发，缩短了后续黄酮类物质干燥的所需的时间，从而缩短了整个工艺流程的时间。

根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮是多穗柯甜味剂中的两种重要的物质，大孔树脂同时分离纯化多穗柯中的根皮苷和新橙皮苷二氢查尔酮，提高了其效率，分离纯化效果较好，为多穗柯甜味剂的开发利用提供了一定的依据。

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