响应面分析法优化微波辅助提取银杏外种皮多糖的工艺研究

申伟崧，刘 毅*，陈效毅

(1.徐州医学院 药学院，江苏 徐州 221004；2.徐州市化工研究所，江苏 徐州 221007)

银杏(GinkgobilobaL.) 为银杏科银杏属多年生落叶乔木，又名白果，是我国特有物种，也是我国独特的药用植物资源。银杏外种皮是种子硬壳外面的肉质部分，长期以来，被作为废弃物被丢弃，造成了资源浪费。银杏外种皮中还含有酚酸性的成分，随意丢弃改变土壤成分和水质，不仅污染土壤还毒死鱼虾，且银杏外种皮具有刺鼻的臭味，也造成了空气的污染[1]。银杏外种皮中的多糖成分含量很高，约含10%以上，粗多糖为黄褐色粉末状，无异味，微甜，对人体无毒副作用，且具有抗炎，抗肿瘤，抗衰老以及增强免疫等多种功能[2-7]，有较好地开发和应用价值。

目前，对银杏外种皮多糖的提取方法研究多集中于加热浸提和超声辅助提取，微波辅助提取的研究鲜有报道。微波辅助浸提技术是近年发展起来的一种新型物理破壁方法，其原理是利用微波辐射压强产生的骚动效应、空化效应和热效应引起机械搅拌、加速了细胞内物质的扩散溶解。与传统热水浸提方法相比，具有节能、快速、效率高等优点，而超声辅助虽采取相似的原理，但往往需要相对较长的处理时间。本文采用响应面分析法对微波辅助提取银杏外种皮多糖进行研究[8]，对充分利用银杏资源，减少环境污染，提高银杏的经济总量，具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

银杏外种皮(采于江苏姜堰，干燥后，除杂粉碎，过40目筛，制成银杏外种皮粉末备用)

1.2 仪器

752N紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，FA1004B电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，TDA温度控制仪(北京永光明医疗仪器厂)，FW100高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，DS-1真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)，EM-202MS1微波炉(荣事达三洋电器股份有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 银杏多糖的含量测定

本实验采用硫酸-苯酚法测定多糖含量[9]。

称取105 ℃干燥恒重的葡萄糖5.2 mg、10.1 mg、20.2 mg、25.2 mg，分别置于100 mL容量瓶中，定容，摇匀。分别移取2ml标准溶液于烧杯中，加入6%苯酚溶液1 mL以及浓硫酸5 mL，静置30 min，至室温，于490 nm下测定吸光度A。以葡萄糖含量为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。

图1 硫酸-苯酚法标准曲线

标准曲线的回归方程为：y=0.6936x+0.6177，方程拟合度R2=0.9994，线性关系良好。

1.3.2 银杏外种皮多糖的提取[10-12]

准确称取银杏外种皮粉末1 g，按一定的料液比加入蒸馏水进行微波处理，在沸水浴中浸提一段时间，4层纱布过滤，重复3次操作，合并滤液，浓缩，醇沉，抽滤，用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤滤饼，冷冻干燥，得到粗多糖。

1.3.3 单因素实验

实验以1 g银杏外种皮为原料，对微波处理时间、料液比、浸提时间[11]3个因素进行单因素的研究，分别讨论其对多糖收率的影响。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 微波时间对银杏外种皮多糖收率的影响

在5个三角烧瓶中加入1 g银杏外种皮，按料液比25 mL·g-1加入蒸馏水，分别在功率700 W下微波处理6、8、10、12、14 min，然后在沸水浴中浸提2.5 h，3 000 r/min离心30 min，取上清液测定多糖含量。结果如图2所示。

图2 微波时间对银杏多糖收得率的影响

由图2可知，微波辅助处理6～12 min之间，银杏外种皮多糖收得率随着微波辅助处理的时间增加而增加，且增加趋势显著。可能由于微波时间过长，导致多糖焦化或水解，超过12 min后多糖的收得率有所下降。故微波辅助处理时间选择12 min为宜。

2.1.2 料液比对银杏外种皮多糖收率的影响

在5个三角烧瓶加入1g银杏外种皮，分别加入10、15、20、25、30 mL蒸馏水，在功率700 W下微波处理12 min，然后在沸水浴中浸提2.5 h，3 000 r/min离心30 min，取上清液测定多糖含量。结果显示如图3所示。

图3 料液比对银杏多糖收得率的影响

由图3所示，随着料液比的增加，银杏外种皮多糖得率也随之增加，当料液比达到1∶30时，多糖收得率增加趋势明显，但料液比在10～25时，增长幅度较大，超过25后收率增加缓慢。由于初期加水过多会引起后续浓缩醇沉操作时长增加，造成能源浪费，故选择料液比为1∶25较为适宜。

2.1.3 浸提时间对银杏外种皮多糖收率的影响

在5个三角烧瓶加入1 g银杏外种皮，按料液比25 mL·g-1加入蒸馏水，在功率700 W下微波处理12 min，然后在沸水浴中分别浸提1、1.5、2、2.5、3 h，3 000 r/min离心30 min，取上清液测定多糖含量。结果显示如图4所示。

图4 浸提时间对银杏外种皮多糖收得率的影响

由图4可知，在3 h之内银杏外种皮多糖收得率随着浸提时间的增加而增加，但浸提时间超过2 h，由于多糖浓度趋于饱和，得率趋于平缓。从节约多糖制备后续工艺的时间和节约资源的原则出发，浸提时间选择2.5 h较为合适。

2.2 响应面分析

2.2.1 响应面分析实验

为克服单因素轮换法实验存在无法判定各因素对反应影响的主次关系和不易寻找最佳反应条件组合等问题。基于单因素实验，以多糖收率为响应面值，根据Box中心组合设计原理[13]设计三因素三水平响应面分析实验，对银杏外种皮多糖提取工艺进行优化，共有15个实验点，其中12个为分析因子，3个为零点。零点实验进行3次，以估计误差。见表1和表2。

表1 响应面实验因素与水平表

表2 响应面分析实验结果

用SAS中的响应面回归Rereg程序[13]对表4中的数据进行回归分析，回归拟合方程为：

(3)

方程Y各项回归系数具体数值和方差分析见表3和表4。并运用SAS，对回归模型进行规范形分析，可得响应面等值线分析图，如图5、图6和图7所示。

表3 回归方程中回归系数表

表4 回归方程方差分析

图5 微波时间和料液比

图6 微波时间和浸提时间

图7 料液比和浸提时间

各项方差分析结果表明，方程一次项和二次项都有较高的显著性，说明微波作用时间、料液比和浸提时间三因素对消旋率的影响不是单一线性关系。交互项均不显著，说明三因素之间的相互影响对响应值的影响可忽略不计。失拟项F不显著，误差均方根(Root MSE)为0.025 8，判定系数(R-Square)为0.999 8，表明该方程对实验拟合情况良好，试验误差小。从规范形分析所得的等值线图可以较直观地看出各因素较好的取值范围，及微波作用时间和浸提时间是影响银杏外种皮多糖提取的重要因素，其次是料液比。

2.2.2 微波辅助银杏外种皮多糖提取优化及验证

应用Box的Complex Algorithm法对上述回归方程取一阶偏导数并令其等于零，可得X1、X2和X3的值分别为0.674、0.833和0.473，经换算为原变量取值是反应条件在料液比29.17加入蒸馏水，在功率700 W下微波处理13.35 min，然后在沸水浴中浸提2.74 h，反应可以取得最佳的响应值，在此条件下模型预测最佳响应值为14.135%。为便于实际操作取料液比29，在功率700 W下微波处理13 min，然后在沸水浴中浸提2.75 h，为最佳反应条件。以RSM所得最佳条件进行3次实验，分别得到多糖收率为13.92%、13.97%和13.85%，平均值为13.91%，逼近模型预测的最佳响应值。

3 结 论

将微波技术应用于银杏外种皮多糖的提取，并用响应面分析法优化提取工艺，采用合理的实验设计，依据回归分析确定各因素对多糖得率的影响，取得了比较好的结果，经优化后确定超声波辅助提取黑木耳多糖的最佳工艺条件为: 料液比29，在功率700 W下微波处理13 min，然后在沸水浴中浸提2.75 h，多糖收率为13.913%。

参考文献：

[1] 赵肃清,李峰,孙远明.银杏外种皮的研究进展[J].武汉植物研究,2000,18(6):515-518.

[2] 许爱华,顾维戎,许正新.银杏外种皮多糖的抗炎作用[J].扬州医学院学报,1991,3(1):4-6.

[3] 许爱华,陈华圣,项晓仁,等.银杏外种皮多糖对小鼠肿瘤的抑制作用[J].中药药理与临床,1996,12(5):24-27.

[4] 费文勇,彭爱军,王爱萍,等.银杏外种皮多糖拮抗D-半乳糖致小鼠衰老作用的实验研究[J].辽宁中医学院学报,2004,6(1):56-57.

[5] 许爱华,陈华圣,王玲,等.银杏外种皮多糖对不同状态小鼠血清SOD和MDA形成的影响[J].中国中药杂志,1998,23 (12):746-747.

[6] 许爱华,王玲,陈华圣,等.银杏外种皮多糖延缓小鼠衰老的实验研究[J].中药材,1996,19(9):466-468.

[7] 顾维戎,许爱华,汪正兴.银杏外种皮对小鼠免疫功能的影响[J].扬州医学院学报,1989,1(1):4-6.

[8] 王雪,王振宇.响应面法优化超声辅助提取黑木耳多糖的工艺研究[J].中国林副特产,2009(3):1-5.

[9] 张惟杰.糖复合生化技术研究[M].2版.杭州:浙江大学出版社,1999 :11-12.

[10] Chen Qun,Yang Guiwen,An Liguo.Apoptosis of hepatoma cells SMMC-7721 induced byGinkgobilobaseed polysaccharide [J].World J Gastroenterol,2002,8(5):832-836.

[11] 宋根平,许爱华,陈华圣,等.银杏外种皮多糖的成分分析[J].中药材,1997,20(9):461-463.

[12] 王桃云,董五科,杨进军,等.超声辅助提取银杏外种皮多糖工艺优化研究[J].安徽农业科学,2008,36(28):12072-12074.

[13] Montgomery D C.实验设计与分析[M].汪仁官,等译.北京:中国统计出版社,1998: 591-641.

[14] 阮桂海.SAS统计分析实用大全[M].北京:清华大学出版社,2003: 188-204.