甲胎蛋白化学发光免疫定量检测试剂的研制与临床应用

戴志文 ，蔡祥霞 ，杨湘越 ，戴振贤 ，谢玉玲 ，薛正翔 ，吴玉水

(1、福建省洪诚生物药业有限公司，福建 莆田351254；2、解放军临床检验医学研究所,福建 福州350025)

肿瘤标志物的血清含量水平与恶性肿瘤的发生、发展、消退、复发等具有良好的相关性。定量检测肿瘤标志物的血清含量对相关恶性肿瘤的早期诊断、疗效和预后判断等均有重要参考价值。但是，目前发现的用于肿瘤筛查诊断的标记物大都在患者体内含量很低，一般的检测方法不够敏感，难于精确定量测定。化学发光免疫检测技术具有灵敏度高、线性范围宽、光信号持续时间长、结果稳定、重复性好、检测快速、绿色环保、便于自动化及实验室之间的标准化等优点[1]。

甲胎蛋白 (AFP)是早期诊断原发性肝癌最敏感、最特异的指标，70～95%的原发性肝癌患者的AFP升高。目前临床实验室大多采用国外的检测系统，检测成本高昂。因此，研制肿瘤标志物化学发光免疫定量检测试剂具有重要社会效益和经济价值。本文报道甲胎蛋白(AFP)肿瘤标志物化学发光免疫定量检测试剂的研制及其检测方法的建立，并初步进行临床应用评价。

1 材料与方法

1.1 样本来源 解放军临床检验医学研究所2011年8月22日至2011年11月3日临床血清样本351份，所有血清均-20℃保存待检。男241份,女109份,年龄 17～92岁，平均 53.2岁。

1.2 主要试剂与仪器 鲁米诺化学发光底物液 (自制)；AFP标准品、AFP包被抗体和辣根过氧化物酶标记的AFP抗体均购自美国辉瑞公司；AFP国家参考品购自中国药品生物制品检定所 (批号：150542-0004)；HC-CLA-III化学发光分析仪(洪诚公司产品)；洗板机(北京天石公司)；对照试剂为：西门子公司生产的AFP定量检测试剂 (批号：110764)；白色不透明微孔板购自深圳市金灿华实业有限公司。

1.3 方法

1.3 .1校准品的配制 将AFP抗原原液标定后溶于小牛血清中,配制成含0,5,25,75,150,400 ng/ml的校准品溶液。

1.3 .2 Anti-AFP-HRP溶液的制备 用含有50%小牛血清的PBS将HRP标记的AFP抗体作适当稀释,2～8℃下保存备用。

1.3 .3抗体包被板的制备 将AFP包被抗体用0.05 mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液作不同浓度稀释后，向微孔板各孔中加入100μl，4℃包被过夜，弃去包被液，加入含10g/L牛血清白蛋白的PBS缓冲液封闭，4℃封闭过夜。弃去封闭液，除湿干燥后备用。

1.3 .4实验操作方法 采用双抗体夹心一步法定量检测 AFP 含量。 实验设校准品(0、5、25、75、150、400ng/ml)共6孔以及待检样品孔等。简要操作步骤如下：分别向微孔板中加入各校准品或样品(每孔25μl)，再加酶结合物50μv混匀后，置37℃温育60min；用PBS洗孔5次，拍干。每孔加发光底物液A和B各50μl，混匀后室温避光放置10min。最后用化学发光分析仪测量各孔相对发光值(RLU)。绘出剂量-反应曲线，从剂量-反应曲线求得样品的AFP含量。

1.4 试剂性能评估

1.4 .1 准确性实验 将研制的三批次 (批号：120618、120628、120708)AFP化学发光免疫定量检测试剂分别用于测定AFP国家参考品 (检测方法同上)，其结果的相对偏差应在±10%以内。

1.4 .2灵敏度 平行测定20孔零值校准品血清，以S0+2SD作为试剂盒的最低检测浓度。

1.4 .3精密度 平行测定两个不同浓度(12ng/mL和120 ng/ml)的质控血清各20孔，求出批内和批间变异系数。

1.4 .4特异性实验 用人血清白蛋白(10000ng/ml)、癌胚抗原(80ng/ml)、糖类抗原 125(500U/ml)、糖类抗原 15-3(500U/ml)、糖类抗原19-9(400U/ml)与研制的AFP抗体包被板进行交叉反应检测 (检测方法同上)，其测定结果均应小于2.5ng/ml。

1.4 .5稳定性实验 将所研制的AFP化学发光诊断试剂(批次：120708)置37℃3d后，用于AFP检测试剂国家参考品的测定分析(检测方法同上)，测定结果应符合产品质量标准。

1.5 与进口对照试剂比对 将研制的AFP检测试剂(考核试剂，批次:120221)与西门子公司生产的AFP定量检测试剂(对照试剂，批次:110764)同时对350份临床样本进行比对检测。严格按照试剂盒中操作步骤进行检测，并在试剂盒有效期内使用。以正常人血清的AFP含量小于10ng/ml为判定标准，将临床样本检测值按阴阳性结果进行统计分析，求出灵敏度、特异性和总符合率；并对两种试剂的测定值进行相关性分析，求出相关系数r值。考核试剂与对照试剂检测结果之间的一致性比较采用Kappa值进行分析。

2 结果

2.1 剂量-反应曲线 以所配制校准品浓度的对数为横坐标，发光值的对数为纵坐标，用双对数数学模型Log-Log函数处理，剂量-反应曲线线性方程Y=1.0416X+3.156，线性相关系数r=0.9999，表明所建立的化学发光免疫定量检测方法具有良好的剂量反应线性关系。

2.2 准确性 三批试剂 (批号：120618、120628、120708)用于测定AFP检测试剂国家参考品，检测结果均符合质量标准 (质量标准及检测结果见表1)。

2.3 稳定性 将所研制的试剂 (批次：120708)置37℃3d后，用于AFP检测试剂国家参考品的测定分析。测定结果表明试剂的各项性能符合产品质量标准要求(见表1)。

2.4 特异性 检测结果表明人血清白蛋白(10000 ng/ml)、癌胚抗原 (80ng/ml)、糖类抗原125(500U/ml)、糖类抗原 15-3(500U/ml)、糖类抗原 19-9(400 U/ml)的测定结果均小于2.5ng/mL，符合质量标准要求。

2.5 与进口对照试剂比对 以西门子的AFP试剂盒检测结果为参照标准，特异性 (阴性符合率)=(199/200)×100%=99.50%；灵敏度 (阳性符合率)=(148/150)×100%=98.7%； 总 符 合 率=(347/350)×100%=99.1%(见表 2)。与对照试剂比对，Kappa值=0.98，一致性强度最强(0.81～1.0)。两种方法检测结果具有良好相关性(相关系数r=0.9823，见图1)。

表1 AFP检测试剂国家参考品测定结果

表2 两种检测试剂350份临床样本AFP测定结果对比

图1 两种检测试剂350份临床样本AFP测定值的相关性分析

3 讨论

原发性肝癌患者血清AFP水平显著高于肝硬化患者和健康体检者，而肝硬化患者血清AFP水平又显著高于健康体检者。AFP水平升高对原发性肝癌及肝硬化等肝病的诊断具有重要价值，对血清AFP升高者，可通过阈值判断患者是原发性肝癌或者肝硬化。对患者血清AFP水平进行动态观察，发现慢性肝炎、肝硬化患者血清AFP水平升高多为一过性升高或呈反复波动性，而原发性肝癌患者多为稳定持续性升高。朱瑜等临床实验结果表明血清肿瘤标志物中AFP的检测对于乙型肝炎相关肝癌具有诊断价值[2]。

化学发光免疫法同时具备了高灵敏度、高特异性、定量检测范围宽、无环境污染等优点,而且其检测用仪器兼容性好,价格相对便宜易于普及和推广,因此近几年来在国内发展迅猛。然而,目前国内用于化学发光免疫法测定用的试剂大都以进口试剂为主,这些试剂与所用仪器采用封闭式系统,使得试剂与仪器必须相互依赖、相互配套,同时由于进口试剂和仪器的价格比较昂贵,也不利于在国内的普及和推广。因此,研制肿瘤标志物化学发光免疫定量检测试剂具有重要社会效益和经济效益。

我们采用AFP单抗包被微孔板，以辣根过氧化物酶标记的AFP抗体为二抗，结合鲁米诺化学发光底物系统，研制了AFP化学发光免疫定量检测试剂并建立了检测方法。实验结果表明，所研制的试剂性能符合AFP检测试剂国家参考品各项质量标准要求。试剂的批内变异系数4.1%～5.2%、批间变异系数4.7%；试剂盒置37℃考核3d，其稳定性良好。并且与其他的肿瘤标志物无交叉反应，特异性高。与进口西门子对照试剂同时检测临床血清样本350份，结果表明两种检测方法具有良好相关性(相关系数r=0.9823)。以正常人血清的AFP含量小于10ng/mL为判定标准，将临床样本的检测值按照阴阳性结果进行统计分析，结果阴性符合率99.5%、阳性符合率98.7%，总符合率为99.1%，Kappa值为0.98,两种方法检测结果的一致性强度为最强，表明所研制的AFP化学发光免疫定量检测试剂与市售的进口同类产品同效。本文成功建立了快速、特异、敏感和稳定的肿瘤标志物AFP化学发光免疫定量检测试剂并建立其检测方法，适合在临床上推广应用。

[1]汪晨,吴洁,宗晨,等.化学发光免疫分析方法与应用进展[J].分析化学,2012,40(1):3-10.

[2]朱瑜.AFP、CEA、CA199诊断乙型肝炎相关肝癌初步研究[J].实验与检验医学,2011,29(5):541-542.