分光光度法测定一级大豆油色泽的研究

付元元，毕艳兰，彭 丹，谭丹丹，孙尚德，刘 伟

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

0 引言

色泽是评价食用油质量的指标之一，它直接影响油脂的外观.油脂色泽受多种因素影响，如油料种类、产地、色素种类与含量、储存环境、精炼程度等对其均有影响[1].目前色泽的测定采用罗维朋比色法，主要依靠人的视觉判断来完成，故结果易受测试人员主观因素的影响，误差较大.

自20 世纪40 年代末就有人提出以分光光度法代替罗维朋比色法[2].Wan 等[3]对比了罗维朋目视比色法与自动比色法对精炼棉籽油的测定效果，判定系数r2为0.99.Santana 等[4]对生物柴油的ASTM 颜色值与透光率进行了研究，得出二次回归方程为：y=4.307×10-5x2-4.545×10-2x+9.622，r2达0.999 7，其中y 为ASTM 颜色值，x 为400～700 nm之间透光率面积.孙凤霞等[5]研究了图像处理红值与罗维朋红值的关系，结果准确，重复性好.我国国标规定罗维朋比色法为测定油脂色泽的标准方法[6]，但需要有经验的操作者来测定.霍权恭等[7]、钟海雁等[8]根据罗维朋红片的最大吸收波长535 nm，研究罗维朋红值与菜籽油、芝麻油等在此波长处吸光度的关系，r2均在0.9 以上，但罗维朋红片的特征吸收波长并不一定与所研究油脂的最大吸收峰波长一致.吴婧等[9]研究了罗维朋比色法和分光光度法对茶叶籽油色泽测定的差异，得出罗维朋比色法只适于常规检测，精确检测茶叶籽油中色素含量可采用640～690 nm 内每纳米吸光度之和来表示，r2可达0.936 4.

这些研究均是以红值的特征吸收波长为基础，研究的油脂颜色较深，对于浅色油则未必可行.至今没有人研究罗维朋黄值与分光光度法的关系，这是因为若不固定黄值，将有黄、红两个变量，难以控制.但由于油脂本身底色不一，固定黄值得到的红值与油脂的真实色泽相差较大.本研究采用色泽较浅的一级大豆油，研究了分光光度法与罗维朋比色法在固定黄值与不固定黄值时的关系.

1 材料与方法

1.1 试验材料

由河南阳光油脂集团下属的3 个加工厂提供的不同批次一级大豆油16 种；于当地超市购买不同厂家生产的一级大豆油6 种；由深色一级大豆油与购买的一级大豆油随机配制38 种（其中由133.4 mm 比色槽测定罗维朋值最高为黄20 红2.0，其余37 种均低于此值；国标规定133.4 mm 比色槽测定一级大豆油的罗维朋值为：黄≤20，红≤2.0）.

1.2 仪器与试剂

TINTOMETER MODEL E 罗维朋比色计：英国；WSL-2 比较测色仪：上海易测仪器设备有限公司；TU1810 紫外-可见分光光度计、T6 新世纪紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司.

无水乙醚（分析纯）：洛阳市化学试剂厂.

1.3 试验方法

1.3.1 罗维朋比色法[6]

将罗维朋比色计接通电源，用无水乙醚将133.4 mm 比色槽清洗干净，将待测大豆油倒入槽内约2/3 高度处，检查油内无气泡，澄清透明即可测定.每个油样由两人测定，差别太大时由第3 人测定，选择两组最相近数据的平均值作为最终结果.

固定黄值调节：为避免黄值固定较大而影响红值的测定，选择颜色较浅的大豆油的黄值作为定值，调节其他一级大豆油的红值，使两边颜色一致或最接近，记录结果.

不固定黄值调节：自由调节黄值和红值，直至颜色与油样色泽一致或最接近，记录结果.

1.3.2 分光光度法

打开电脑和紫外-可见分光光度计开关，预热30 min 左右，打开软件，开机自检成功后，设置波谱扫描参数，波长范围为400～800 nm，间隔1 nm，扫描速度为快速.以蒸馏水做参比进行基线校正，再将待测油样移入1 cm 玻璃槽内约2/3 高度处扫描.每次扫描前应用无水乙醚将比色槽清洗干净.各油样均取样两次扫描，扫描完成后导出数据，模拟扫描曲线，在特定波段内积分.

1.3.3 积分方法

将任意相邻纳米之间的图形近似看作是一个梯形，则梯形区域的面积为（Ai＋Ai＋1）/2，其中i=400，401，…，799，Ai为i nm 处吸光度值，Ai+1为（i+1）nm 处吸光度值，1 为扫描间隔1 nm；那么400～800 nm 吸光度区域面积为

2 结果与讨论

2.1 误差分析

（1）不同测试人员使用同一台TINTOMETER MODEL E 罗维朋比色计，测定同一种大豆油的结果见表1.

由表1 可知，不同测试人员使用同一台罗维朋比色计对同一种大豆油的测定结果相差较大.不固定黄值时，黄值相差最高可达14.6，标准偏差为7.5，红值偏差为0.1；而固定黄值时，红值相差可达0.6，标准偏差为0.3.

表1 不同测试人员测定同一种大豆油的结果比较

（2）罗维朋比色计（英国）与比较测色仪（上海）对同一种大豆油的色泽测定结果见表2.

表2 不同比色计测定同一种大豆油的结果比较

由表2 可知，不同的比色计测定同一种大豆油偏差也较大，不固定黄值时黄值标准偏差可达3.5，红值标准偏差为0.1，固定黄值时红值的标准偏差为0.1.

（3）TU1810 紫外-可见分光光度计与T6 新世纪紫外-可见分光光度计扫描同一种大豆油，对430～480 nm 之间吸光度积分结果见表3.

表3 不同分光光度计对同一种大豆油两次测定结果比较

由表1 和表2 可知，比色法的测定依靠视觉判断，受人的主观因素影响，故误差较大，此外仪器的影响也不可忽视.由表3 可知，分光光度法的测定结果受主观影响较小，标准偏差只有0.096，不同分光光度计测定的标准偏差也只有0.226，结果稳定.分光光度法测定大豆油色泽产生的误差主要与仪器本身有关，可基本排除人为因素的干扰，即使采用不同的分光光度计，误差也很小.所以罗维朋比色法的测定结果远不如分光光度法的测定结果可信.

2.2 罗维朋比色法的测定结果分析

采用1.3.1 中的调节方法，对于颜色较浅的27种一级大豆油，固定黄值为3，对于颜色较深的33种一级大豆油，固定黄值为10 时，两边色片的颜色较为满意.

由2.1 中的误差分析可知，罗维朋比色法测定的结果误差较大，在不同测试者、不同测试仪器之间均存在较大误差，因此若将色差过大的一级大豆油的黄值固定为同一水平，较大的黄值会掩盖浅色油的红值，导致测定结果偏离真实颜色.相比之下，黄、红均不固定时的测定结果可在一定程度上避免这种情况.

由黄值和红值的分布（图1）可以发现：一级大豆油以黄色变化为主，黄值越大，红值的分布越宽.并且可以初步确定，自由测定黄值和红值的结果满足关系：0≤R≤0.1Y（Y 为黄值，R 为红值）.综合以上两种分析结果，一级大豆油的罗维朋值不会出现黄值很小、红值很大的情况.

图1 一级大豆油的黄、红值分布图

2.3 分光光度法的测定结果分析

大豆油的颜色主要与其含有的色素种类、含量、加工方法、精炼程度有关，所以不同等级、不同品种的大豆油扫描波谱不同.在400～800 nm 波长内扫描不同颜色的一级大豆油波谱如图2 所示.

由图2 可知，在可见光范围内，一级大豆油的吸收波谱为平滑的曲线，基本没有特征吸收峰，只有极少数大豆油的谱图在罗维朋黄片特征吸收波长635 nm[7]左右有一小峰，但非常不明显；而无论是在罗维朋红片的特征吸收波长535 nm[7-8]处还是在红色最大吸收波长669 nm 处[9]均没有吸收峰，所以对于一级大豆油，研究黄值或红值的特定吸收波长并没有太大意义.而谱图趋势显示，在400～500 nm 之间，随大豆油颜色加深，吸光度逐渐增大，说明大豆油色泽与其吸光度的确呈现一定关系.

一级大豆油呈色的原因有很多，类胡萝卜素、叶黄素等的残留，色原体的氧化，游离脂肪酸本身的颜色等[10]都会影响油脂的色泽，在可见光区有吸收的是类胡萝卜素及叶黄素，而这些色素主要吸收430～480 nm 的蓝紫光[11]，精炼后的一级大豆油中色素含量虽少，但却是决定大豆油色泽的关键因素，而其他的影响因素如加工方式、精炼程度等并不能彻底去除这些色素.所以，本实验主要研究类胡萝卜素及其衍生物的吸收波段430～480 nm和全波段400～800 nm 范围内的积分面积与罗维朋值的关系.

2.4 罗维朋值与分光光度法的关系

2.4.1 固定黄值测定的红值与分光光度法的关系

研究黄值特征吸收波长635 nm、红值特征吸收波长535 nm 处吸光度值与罗维朋值的回归关系发现，两者之间并无规律可循，r2＜0.35，相比之下，全波段与430～480 nm 之间的积分面积与罗维朋值的回归效果较好.

（1）对于浅色一级大豆油，固定黄值为3，罗维朋红值与全波段积分面积关系见图3.

罗维朋红值与430～480 nm 积分面积的回归关系见图4.

由图3、图4 可知，对于色泽较浅的一级大豆油，罗维朋红值与全波段积分面积之间的回归效果很不好，而与430～480 nm 之间的积分面积线性关系稍好，r2接近0.8.造成这种现象的原因有两点：一方面是因为罗维朋比色计本身误差所致，再者油脂颜色普遍较浅，罗维朋比色计对于细小的颜色差别无法区分，使得测定误差更大，这一现象与有关报道[2]增大光程可减小误差的结论一致；另一方面，400～800 nm 的积分范围过宽，无法排除其他影响吸光度大小的因素，导致积分结果带有一定的盲目性.

图3 黄值固定为3，大豆油罗维朋红值与400～800 nm 积分面积的关系

图4 黄值固定为3，大豆油的罗维朋红值与430～480 nm 积分面积的回归关系

（2）对于颜色相对较深的一级大豆油，固定黄值为10，罗维朋红值与全波段积分面积关系的回归结果见图5.

图5 黄值固定为10，大豆油的罗维朋红值与400～800 nm 积分面积的关系

罗维朋红值与430～480 nm 积分面积的回归结果见图6.

对比图5 和图6，两个积分区域与罗维朋红值的线性回归效果均好于浅色一级大豆油，二次多项式的回归效果更理想，相关系数均比浅色一级油高.但很明显选择430～480 nm 积分波段的回归效果要优于全波段，r2可达0.944 7.这是因为大豆油的颜色越深，视觉差异就越大，从而提高了罗维朋值的准确性，即大豆油中含的类胡萝卜素及其衍生物等色素越多，区分效果就越明显.所以罗维朋比色计适合测定深色一级大豆油，而分光光度法对大豆油色泽没有要求，应用更广泛.

图6 黄值固定为10，大豆油的罗维朋红值与430～480 nm 积分面积关系

2.4.2 不固定黄值测定的黄值、红值与分光光度法的关系

黄值和红值均非定值，共3 个变量，所以将其与积分面积绘制成带有等高线的3D 图，通过曲面模型得出三者之间的关系.

一级大豆油的罗维朋黄值、红值与400～800 nm 波段积分面积的关系如图7 所示.

一级大豆油的罗维朋黄值、红值与430～480 nm 波段积分面积的关系如图8 所示.

图7 一级大豆油的黄、红值与400～800 nm 积分面积3D 图

将底面投影图按积分面积大小划分为5 个区域，分别以S1、S2、S3、S4、S5表示，各区域的分布如图9 所示.

对比图7 与图8，罗维朋黄值、红值与全波段积分值的总体效果较差，而与430～480 nm 之间的积分面积在空间内基本呈现良好趋势，近似为一张平滑曲面，与固定黄值的回归效果一致.由3D 图也可以发现，一级大豆油的罗维朋值主要分布在R-0.1Y≤0 内（R 代表红值，Y 代表黄值），即自由调节黄、红色时，一级大豆油的罗维朋色泽满足条件0≤R≤0.1Y，此结论与在测定过程中的规律一致.

图8 一级大豆油的黄、红值与430～480 nm 积分面积3D 图

图9 一级大豆油在430～480 nm 间积分面积的底面分布图

图8、图9 中等高线代表不同色泽的一级大豆油在430～480 nm 间积分面积的分布等级，按积分面积在底面投影划分大豆油色泽等级的效果更明显，等级大小可以根据需要自由确定，同一条等高线上的积分面积相同，即代表同一色泽的油脂.根据等高线的分布可知，积分面积随罗维朋值增大呈上升趋势，所以即使大豆油有微小色差，也可以进行区分.根据图9，一级大豆油在430～480 nm 之间的积分面积主要分为5 个等级，与罗维朋值的对应关系如表4 所示.

统计表明，来自工厂的一级大豆油共22 份，全部分布在S2、S3区，其中S2占95.5%，S3占4.5%.大型工厂加工的一级大豆油色泽普遍较浅，在S1区域（S430～480nm≤1.1）没有分布，若是改变加工水平，大豆油的色泽可进一步降低，甚至达到化妆品用油的加工要求[12].而国标（GB 1535-2003）规定的一级大豆油色泽的临界值位于S5内（S430～480nm=13），说明目前一级大豆油的色泽远低于国家标准，这意味着目前大豆油的加工水平很高，甚至个别项目处于过度加工状态，考虑到出厂后的大豆油在储存中色泽就可能发生改变，所以对于油脂的加工，工厂应做到既要符合标准，又要节约资源，使经济效益最大化.因此，本研究的划分区域合理.

表4 430～480 nm积分面积与罗维朋值对应关系

从表4 可以看出，5 个色泽区域对应的罗维朋值范围有交叉，即罗维朋比色法不能将有微小色差的大豆油分开，依据积分面积区分的效果非常明显，同时避免了因操作者不同对同一大豆油测出多组黄、红值的情况.

通过上述分析可知，采用分光光度法测定大豆油色泽的效果要优于罗维朋比色法.所以，对于整体色泽较浅的一级大豆油，可以采用分光光度法在430～480 nm 之间的扫描面积表示油脂色泽，从而排除应用罗维朋比色计测定时的人为操作误差以及由于颜色过浅而造成的视觉误差，得到更准确的测定结果.

3 验证试验

由市场随机选取一级大豆油5 份，罗维朋值均满足：0≤Y≤20，0≤R≤2.5 份一级大豆油在430～480 nm 之间的积分面积与罗维朋黄值、红值如表5 所示.

通过对比可知，不固定黄值时，1～4 号预测的黄值、红值均在S2区域，5 号处于S3区域，但4 号和5 号的实测罗维朋值分别在S3、S4区域.根据本研究建立的3D 模型可知1～5 号的预测黄值为3.618、8.643、3.920、11.357、16.683，预 测 红 值 为0.1、0、0.1、0、0.3，统计分析显示，5 个大豆油的预测黄值与实测黄值、预测红值与实测红值的差异均不显著（将罗维朋比色法本身较大的误差考虑在内）.固定黄值为3 时，由S430～480=4.994R+1.180 得出的红值与测定的红值、固定黄值为10 时，由S430～480=6.049R+1.474 得出的红值与测定的红值、由S430～480=2.279R2+2.204R+2.757 得 出 的 红 值 与 测 定的红值经分析也均无显著差异.由此可知，根据研究结论得出的计算值与实际测定值具有很好的一致性，总体结果较为客观、稳定.验证试验表明市售一级大豆油基本符合上述关系，本结论可以用于测定不同厂家、不同批次生产的一级大豆油色泽.

表5 分光光度法与罗维朋黄、红值对比

4 结论

本实验针对一级大豆油，研究了分光光度法与罗维朋比色法在固定黄值与不固定黄值两种情况下的关系，并通过绘制3D 图得到分光光度法在430～480 nm 之间扫描面积与罗维朋黄、红值的对应关系.

（1）分光光度法对一级大豆油的测定结果优于罗维朋比色法，受操作人员主观因素影响小，准确性高.对同一种色泽的大豆油，分光光度法的测定结果唯一，可避免罗维朋比色法因操作者不同造成的较大误差.

（2）对于色泽较浅（0≤Y＜10）的一级大豆油，采用公式S430～480=4.994R+1.180，r2=0.789 0；对于色泽较深（10≤Y≤20）的一级大豆油，采用公式S430～480=6.049R +1.474，r2=0.922 9 或 S430～480=2.279R2+2.204R+2.757，r2=0.944 7，由430～480 nm之间吸光度与X 轴围成的面积表示油脂的色泽大小.

（3）一级大豆油在430～480 nm 之间的吸光度值和X 轴所围面积S430～480与罗维朋黄值、红值的对应关系为：0≤S430～480≤1.1 时，0≤Y≤3，0≤R≤0.3；1.1 ≤S430～480≤3.5 时，3 ≤Y ≤10，0 ≤R ≤0.5；3.5 ≤S430～480≤4.3 时，10 ≤Y ≤20，0 ≤R ≤0.7；4.3 ≤S430～480≤7.5 时，7 ≤Y ≤20，0 ≤R ≤1.1；7.5≤S430～480≤13 时，5≤Y≤20，0.9≤R≤2.0.根据上述对应关系，已知一级大豆油在430～480 nm 之间的积分面积，就可基本确定黄值和红值的范围.

本研究因取样数量少、地域所限不能完全覆盖一级大豆油的色泽，人为的操作误差也会在一定程度上影响3D 图的表达效果.后续研究可扩大取样的数量，按油脂种类、等级进行进一步研究，还可根据需要自行划分积分面积增量，或建立积分面积、黄值、红值之间的标准3D 模型，得出三者对应的具体数值，从而使分光光度法在油脂色泽的测定中发挥更大的作用.

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