羊水ABH血型物质测定与ABO血型基因分型＊

陈 江，逯心敏，郭 渝，胡 伟

（四川省宜宾市第二人民医院检验科，四川宜宾 644000）

羊水ABH血型物质测定与ABO血型基因分型＊

陈 江，逯心敏，郭 渝，胡 伟

（四川省宜宾市第二人民医院检验科，四川宜宾 644000）

目的通过检测羊水ABH血型物质和序列特异性引物-聚合酶链反应（PCR-SSP）基因技术检测胎儿羊水细胞ABO血型基因型，鉴定胎儿ABO血型。方法选取妊娠16～25周的孕妇53例，抽取羊水，利用间接凝集实验测定羊水ABH血型物质；将羊水细胞进行分离，提取羊水细胞DNA，运用PCR-SSP技术分析其ABO血型基因型。结果16例羊水标本为非分泌型，占30.2%，37例羊水标本为分泌型，占69.8%；48例羊水标本通过PCR-SSP方法检测出了ABO血型的基因型。经基因鉴定的胎儿羊水细胞ABO血型与羊水分泌型ABH血型物质检测结果一致。结论PCR-SSP技术可以准确地检测胎儿羊水细胞的ABO血型。

ABO血型系统；羊水；细胞；序列特异性引物-聚合酶链反应；ABH血型物质

母婴血型不合，可引起胎儿或新生儿时期的免疫性溶血病。母体产生的免疫抗体，通过胎盘进入胎儿体内，可使胎儿红细胞凝集，发生溶血，引起死胎、死产、出生缺陷及新生儿溶血病［1－2］。为了有效预防新生儿溶血病的发生，产前确定胎儿血型十分必要，为此本文抽取了53例孕妇羊水，通过测定胎儿羊水ABH血型物质和序列特异性引物－聚合酶链反应（polymerase chain reaction with sequence specific primes，PCR-SSP）基因分型检测胎儿羊水细胞ABO血型，来判断胎儿血型。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2011年3～10月在本院孕16～25周、年龄21～38岁的孕妇53例，采集羊水（双方签署知情同意书），每人2份，取样注意避免母血污染。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂与材料 抗血清：抗A效价1∶64，抗B效价

1∶128，抗 H效价1∶32，购自长春博德；PCR-SSP ABO血型试剂，购自天津秀鹏生物技术开发有限公司；DNA提取试剂，购自杭州博日科技有限公司。

1.2.2 标准抗血清制备 （1）标记试管：3排18支，分别抗A、抗B及抗 H。每排再标2、4、8、16……。（2）稀释：每管加生理盐水50μL。每排第1管对应加抗A、抗B及抗H血清50μL，倍量稀释成2、4、8、16……稀释液。（3）加2%悬红：每排各管对应加悬红50μL，振摇混匀，1 400r／min，离心15s。（4）结果：以3＋为标化血清的最适稀释度。

1.2.3 羊水ABH血型物质测定 （1）无菌抽取羊水5～10mL，经1 400r／min离心5min后留取上清液备用。（2）排列试管3支，分别标明A、B、H，3管各加羊水1滴，每管加相应标准抗血清1滴。混匀，置室温，中和10min。（3）每管加相应2%标准红细胞悬液1滴，混匀，1 400r／min离心15s，观察结果。

1.2.4 羊水细胞培养 取羊水专用培养基［3］，加入新鲜小牛血清（56℃，30min灭活补体），使终浓度达到10%。将5～10mL羊水接种于上述培养基中，置5%CO2孵箱中，37℃饱和湿度下培养，每隔48h换培养基。培养3～5d后，在倒置显微镜下观察，如细胞贴壁生长良好。大部分或全部爬壁生长良好后，即可终止传代生长。

1.2.5 引物设计 引物验证经Primer 5.0软件设计，通过NCBI-BLAST数据库，输入相应引物进行验证确认。O1基因型：上游引物5′-TTA AGG GGA AGG ATG TCC TCG TCGTA-3′，Non O1基因型：下游引物5′-TAA GTG GAG GAGTG AGT TGT G-3′，共 同 引 物 5′-ATA TAT ATG GCA AAC ACA GIA ACC AAT G-3′；O2基因型：上游引物5′-GAC CCC CGG AAG AAG CTA TTG GA-3′，Non-O2基因型：下游引物5′-CGA CCC CCG CAA GAA GGC C-3′，共同引物5′-AGT GGA CGT GGA CAT GGA GTT CC-3′；B基因型：上游引物5′-ATC GAC CCC AGG GGA AGA CAG G-3′，Non-B 基 因型：下游引物5′-CCG ACC CCC CGA AGA GCC-3′；A2基因型：上游引物5′-GAG GCG GTC CGG AAG CG-3′，Non-A2基因型：下游引物5′-GAG GCG GTC CGG AAC ACG-3′，共同引物5′-GGG TGT GAT TTG AGG TGG GGA C-3′。

1.2.6 羊水细胞的DNA提取 将收集的羊水细胞于2 500 r／min离心10min，弃去上清液；再加入生理盐水5～10mL，2 500r／min离心10min，弃去上清液。采用博日DNA提取试剂盒快速提取羊水细胞DNA，通过2%琼脂电泳鉴定提取的质量。

1.2.7 PCR扩增 PCR反应体系为20.0μL含模板2.0μL（约50ng），引物1.5μL，dNTP 1.6μL（0.4mmol），10×Buffer缓冲液2.0μL，Taq酶1.0U，加双蒸水至20.0μL；PCR反应条件为94℃预变性4.0min，94℃变性1.5min，52℃退火2.0min，72℃延伸2.0min，共30个循环。

1.2.8 PCR扩增产物的检测 取PCR扩增产物2.0μL，2.5%琼脂糖凝胶电泳（T＝6.0%，C＝3.3%，凝胶规格为82mm×64mm×0.75mm）。电极缓冲液为1×TBE。将加有1／5体积上样缓冲液的酶切产物电泳，电压220V，电泳20～30min。紫外线下成像。结果判断见相应说明书。

2 结 果

2.1 羊水ABH血型物质检测结果及分布 53例羊水ABH血型物质结果中非分泌型16例（30.2%），A型分泌型13例（24.5%），B 型 分 泌 型 6 例 （11.3%），0 型 分 泌 型 15 例（28.3%），AB型分泌型3例（5.7%）。

2.2 PCR-SSP法检测结果 53例羊水细胞DNA除5例未能正确检出，其余均测出ABO血型。表现型为A型有18例，基因型 O1A1：7例，A1A1：2例，A1O2：9例；B型有8例，其基因型为O1B：4例，O2B：4例；表现型为O型有19例，其基因型为O1O1：3例，O1O2：11例，O2O2：5例，表现型为 AB型有3例，基因型均为A1B。

2.3 结果比对 除非分泌型的结果和无效检测结果外，孕妇羊水血型物质分泌型检测结果与基因分型结果均一致，说明两种方法能达到临床检测的要求。

3 讨 论

血型是以血液抗原形式表现出来的一种遗传性状，已经发现并成为国际输血协会承认的血型系统有30多种［4］，ABO血型是最早发现的一个血型系统，也是应用最广、与临床输血最密切、最重要、研究和认识较深入的一个血型系统。ABH血型抗原在5～6周胎儿RBC已可测出［5］，出生时抗原性只达成人的25%～50%，在出生后18个月时才能充分表现出抗原性［6］。

所有ABO血型的抗原都由H物质合成而来，Se／se基因和H／h基因都可以控制合成H物质。Se／se基因的表达决定体液中是否出现ABH抗原，决定ABH抗原为分泌型或非分泌型，人类的这种分泌状态受控于分泌座位（FUTZ）的一对等位基因，即Se和se，Se基因编码有活性的为α2-L岩藻糖基转移酶；se是无效基因。大部分群体的20%为非分泌型，是se基因的纯合子。H／h基因的表达决定RBC上是否出现ABH抗原。再依ABO基因表达的不同，合成出不同抗原形成不同的 ABO 血型［7］。

母婴ABO血型不相容是临床新生儿溶血症的常见原因，新生儿溶血病起源于胎儿从父亲方面继承了一些母亲没有的RBC抗原，使得母婴血型不合，母体存在与胎儿RBC血型抗原相应的免疫性抗体，此免疫性抗体可以通过胎盘进入胎儿体内，并包被在胎儿RBC上，在分娩前、后加速胎儿RBC破坏发生溶血，造成胎儿发生以溶血为主要损害的一种被动免疫性疾病［8］，常常导致胎儿宫内感染，早产、胎儿智力低下，严重的造成胎儿死亡。国内常见的血型不合引起的新生儿溶血为ABO及Rh血型不合，其中以ABO不合者居多，Rh不合者次之［9］。因此，及早分析胎儿的血型，对于预防和治疗具有重要的临床意义，胎儿的血型鉴定以前主要是通过胎儿父母的血型，按照孟德尔遗传规律推算出的子代血型，具有一定的盲从性和主观性，通过宫内穿刺采集胎儿血液进行胎儿血清学的ABO鉴定，有较大的风险性，容易造成胎儿损伤，甚至导致胎儿死亡，且胎儿ABO血型抗原发育不成熟，RBC的凝聚力只有成人的20%，常常导致血型鉴定困难容易造成错判或误判［10］。

人类ABO基因定位于第9对染色体长臂末端，ABO血型系统的3个基因，由7个外显子组成［11］。ABO血型系统不同的表型是由其基因水平上的几个核苷酸的不同所决定［12］。PCR-SSP技术检测ABO血型基因型是利用ABO基因发生突变位点的不同核甘酸，分别设计一系列序列特异性引物，直接扩增ABO血型基因型物质片段从而测得ABO血型及其亚型［13－14］。

本次实验共收集到53例羊水标本，均来自为16～25周的健康孕妇，通过间接凝集抑制试验测得的ABO分泌型37例（69.8%），非分泌型16例（30.2%），稍高于文献报道［15］，可能为胎儿尚未成熟，羊水中分泌较少。同时对53例羊水标本进行了细胞培养，通过PCR-SSP技术进行了基因分型，除5例标本可能因提取DNA相对不够加之天气炎热，DNA可能降解，未能成功检测外，其余均能正常检测，PCR-SSP技术鉴定胎儿羊水细胞血型实验显示，结果清晰可靠，方法可行，与分泌型的检测比对结果均为一致。

本研究表明，采用PCR-SSP法检测胎儿羊水细胞ABO血型基因型来确定胎儿血型是准确可靠的。可有效克服常规血清学检测技术的不足和新生儿血型免疫系统不完善，以及血型结果影响因素较多的问题。能较早快速准确地鉴定胎儿血型，可直接用于临床检测，有助于临床新生儿溶血症的预防和治疗。

［1］Towns D，Hannon J，Hendry J，et al.Hemolytic disease of the fetus and newborn caused by an antibody to a lowprevalence antigen，anti-SARA［J］.Transfusion，2011，51（9）：1977-1979.

［2］Sammar M，Nisemblat S，Fleischfarb Z，et al.Placenta-bound and body fluid PP13and its mRNA in normal pregnancy compared to preeclampsia，HELLP and preterm delivery［J］.Placenta，2011，32Suppl：S30-36.

［3］Roubelakis MG，Bitsika V，Zagoura D，et al.In vitro and in vivo properties of distinct populations of amniotic fluid mesenchymal progenitor cells［J］.J Cell Mol Med，2011，15（9）：1896-1913.

［4］Franchini M，Favaloro EJ，Targher G，et al.ABO blood group，hypercoagulability，and cardiovascular and cancer risk［J］.Crit Rev Clin Lab Sci，2012，49（4）：137-149.

［5］Moussa H，Tsochandaridis M，Jemni-Yacoub S，et al.Fetal RhD genotyping by real time quantitative PCR in maternal plasma of RhD-negative pregnant women from the Sahel of Tunisia［J］.Ann Biol Clin（Paris），2012，70（6）：683-688.

［6］Gloria-Bottini F，Cozzoli E，Neri A，et al.Effect of smoking and ABO blood groups on maternal age at child bearing and on birth weight［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2011，159（1）：83-86.

［7］Emeribe AO，Igweagu CA，Osim EE.ABH secretor status in saliva of Calabar Municipality residents［J］.East Afr Med J，1992，69（1）：27-30.

［8］Stasi R.Rozrolimupab，symphobodies against rhesus D，for the potential prevention of hemolytic disease of the newborn and the treatment of idiopathic thrombocytopenic purpura［J］.Curr Opin Mol Ther，2010，12（6）：734-740.

［9］Zuppa AA，Cardiello V，Lai M，et al.ABO hemolytic disease of the fetus and newborn：an iatrogenic complication of heterologous assisted reproductive technology-induced pregnancy［J］.Transfusion，2010，50（10）：2102-2104.

［10］Klarmann D，Eggert C，Geisen C，et al.Association of ABO（H）and I blood group system development with von Willebrand factor and FactorⅧplasma levels in children and adolescents［J］.Transfusion，2010，50（7）：1571-1580.

［11］Klimant E，Glurich I，Mukesh B，et al.Blood type，hormone receptor status，HER2／neu status，and survival in breast cancer：a retrospective study exploring relationships in a phenotypically well-defined cohort［J］.Clin Med Res，2011，9（3／4）：111-118.

［12］Jukic I，Bingulac-Popovic J，Dogic V，et al.Evaluation of ABO blood groups as a risk factor for myocardial infarction［J］.Blood Transfus，2012，11（3）：464-465.

［13］Prager M.Molecular genetic blood group typing by the use of PCR-SSP technique［J］.Transfusion，2007，47（1Suppl）：S54-59.

［14］陈志忠，廖扬勋，陈尚良，等.PCR-SSP基因分型技术在ABO疑难血型定型中的应用［J］.现代检验医学杂志，2011，26（4）：53-55.

［15］张萍.羊水血型物质测定与临床应用［J］.医学创新研究，2008，5（12）：159-160.

Detection of amniotic fluid ABH blood group substances and ABO blood type gene classification＊

ChenJiang，LuXinmin，GuoYu，HuWei
（DepartmentofLaboratory，YibinMunicipalSecondPeople′sHospital，Yibin，Sichuan644000，China）

ObjectiveTo detect amniotic fluid ABH blood group substances and ABO blood group genotype by the polymerase chain reaction with sequence-specific primers（PCR-SSP）to increase the prenatal diagnosis of fetal ABO blood group.Methods53 pregnant women with gestational age 16－25weeks were selected.Amniotic fluid was extracted for detecting ABH blood group substances by the serological indirect agglutinating reaction；the amniotic fluid cells were separated for extracting DNA.Then the PCR-SSP technique was adopted to analyze the ABO blood group genotypes.Results16specimens of amniotic fluid were non-secreting type phenotype（30.2%）and 37specimens of amniotic fluid were secreting type phenotype（69.8%）；48specimens of amniotic fluid were detected out the ABO blood group genotype by the PCR-SSP method.ABO blood group of fetal amniotic fluid cells by the gene identification was consistent to the detection results of amniotic fluid secreting type ABH blood group substances.ConclusionThe PCR-SSP technique can accurately detect the fetal amniotic fluid cells ABO blood group.

ABO blood-group system；amniotic fluid；cell；polymerase chain reaction with sequence specific primes；ABH blood group substances

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.11.008

A

1671-8348（2014）11-1302-02

四川省卫生厅资助项目（20100583）；宜宾市科技局资助项目（2010SF011）。

陈江（1974－），副主任技师，硕士研究生，主要从事分子生物学与流式细胞学研究。

2013-09-28

2013-12-22）

论著·临床研究