补体C5a对肾移植排斥反应中IL-17产生的调节作用*

李蜀婧,郑权友,袁 刚,霍文谦,张克勤

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科,重庆 400042)

补体C5a对肾移植排斥反应中IL-17产生的调节作用*

李蜀婧,郑权友,袁 刚,霍文谦,张克勤△

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科,重庆 400042)

目的探讨肾移植排斥反应中促炎性细胞因子白细胞介素17(IL-17)和补体活化产物C5a的表达情况,以及C5a对IL-17表达的可能调节作用｡方法 流式细胞术(FCM)检测肾移植患者外周血中IL-17+T细胞的频率和C5a刺激后人肾小管上皮细胞系中的HK2细胞IL-17的表达情况;ELISA检测肾移植患者血清C5a水平的变化;免疫组织化学检测并比较正常肾组织和发生排斥反应移植肾组织中IL-17的表达和补体C5b-9的沉积;免疫细胞化学检测HK2细胞在重组C5a刺激前､后IL-17表达的差异｡结果同种异基因肾移植术后,肾移植患者外周血中IL-17+T细胞百分率明显升高,患者血清C5a水平较术前显著增加(P0.01);发生排斥反应的肾组织中IL-17表达与C5b-9的沉积较正常肾脏组织均有明显的上调,二者呈正相关;加入重组的C5a刺激后,HK2细胞IL-17的表达水平显著上调｡结论肾移植排斥反应中补体活化产物C5a可能对IL-17的产生起正向调节作用｡

补体C5a;白细胞介素17;肾移植;移植物排斥

白细胞介素17(interleukin-17,IL-17)是一种重要的促炎性细胞因子[1-2],除了CD4+T亚群外,其他许多细胞亚群如:CD8+T亚群,细胞和中性粒细胞等均可分泌IL-17[3]｡有研究显示,IL-17在器官移植术后急､慢性排斥反应中有着重要的作用[4-6]｡同时,在移植排斥反应中,移植抗原与抗体结合可激活补体系统｡作为补体系统的枢纽分子,C5被激活后可裂解形成C5a和C5b｡C5a是一种重要的炎症介质和趋化因子,通过与靶细胞表面C5aR的结合,发挥其生物学效应[7]｡尽管补体在移植排斥中的重要作用已有不少报道[8-9],但对于小分子C5a在临床移植排斥中的作用机制并不清楚｡本研究检测了同种异基因肾移植术前､后外周血以及发生移植排斥反应肾组织中IL-17和C5a的表达变化,并探讨C5a对肾小管上皮细胞IL-17表达的调节作用｡

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年1月至2013年12月在本院泌尿外科接受同种异基因肾移植手术的患者20例,其中男11例,女9例;年龄24～58岁,平均(40.61±2.21)岁｡移植肾组织标本来源于同期临床诊断为排斥反应的肾组织标本10份及无排斥反应的正常肾组织标本5份｡

1.2 方法

1.2.1 流式细胞术(FCM)检测 FCM检测接受同种异体肾移植患者外周血中IL-17+T细胞的比例和C5a刺激后人肾小管上皮细胞系中的HK2细胞IL-17的表达情况｡外周血中IL-17+T细胞的检测:分别在肾移植手术前(即0h)及术后3､7d,抽取患者静脉血4mL,EDTA-Na抗凝处理｡将抗凝血用PBS倍比稀释后,缓慢加入预加有2mL人外周血淋巴细胞分离液(天津灏洋生物)的离心管中,2 000r/min离心20min,收集单个核细胞层｡在含乙酰肉豆蔻佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)50ng/mL､蛋白转运阻断剂(brefeldin A,BFA)10g/mL和离子霉素(ionomycin)500ng/mL的 RPMI1640完全培养基中培养4h后,收集细胞,加入别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)-抗人CD3(Biolegend)进行表面染色,然后依次用4%多聚甲醛固定细胞15min,0.1%的皂素通透破膜20 min,再加入藻红蛋白(phycoerythrin,PE)-抗人IL-17A(Biolegend)冰上避光反应30min,FCM检测各样品CD3+亚群中IL-17+T细胞的百分率｡C5a刺激后HK2细胞IL-17的表达检测:HK2细胞以8×103个/孔接种于24孔细胞培养板中,贴壁6～8h;无血清培养基饥饿24h后,加入200ng/mL重组人C5a(Hycult biotech)刺激48h;收集细胞,按照上述方法进行染色,FCM检测各处理组细胞IL-17的表达情况｡

图1 同种异基因肾移植手术前､后患者外周血中IL-17+T细胞百分率比较

1.2.2 ELISA技术检测接受同种异体肾移植患者血清C5a的水平 采用BD公司的人C5aELISA检测试剂盒,按照说明书测定血清C5a水平｡

1.2.3 免疫组织化学和免疫细胞化学分别检测组织及细胞中IL-17､C5b-9及C5aR的表达 免疫组织化学:肾脏组织标本常规方法进行石蜡包埋､切片;组织切片脱蜡水化后,0.01 mol/L柠檬酸钠微波法抗原修复,然后用3%H2O2去除内源性过氧化物酶;加入兔抗人IL-17多克隆抗体(SANTA CRUZ)和兔抗人C5b-9多克隆抗体(Abcam);二步法免疫组织化学检测试剂盒(抗兔)PV-9000(中杉金桥)进行后续染色;DAB试剂盒(中杉金桥)显色后苏木素复染;脱水透明后中性树胶封片,拍片｡免疫细胞化学:HK2细胞以8×103个/孔接种于放有盖玻片的24孔细胞培养板中,贴壁6～8h;无血清培养基饥饿24h后,加入200ng/mL重组人C5a(Hycult biotech)刺激48h;取出细胞爬片,4%多聚甲醛固定,3%H2O2去除内源性过氧化物酶,正常山羊血清封闭;加入兔抗人IL-17多克隆抗体(SANTA CRUZ)和兔抗人C5aR单克隆抗体(Abcam);即用型免疫组织化学超敏(UltraSensitiveTM)SP(抗兔)试剂盒(福州迈新)进行后续染色;DAB试剂盒(中杉金桥)显色后苏木素复染;中性树胶封片后拍片｡

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 5.0进行统计分析,计量资料以±s表示,统计分析采用非配对的t检验,以P0.05为差异有统计学意义｡

2 结 果

2.1 同种异体肾移植手术前､后患者外周血细胞中IL-17+T细胞百分率比较 对患者外周血淋巴细胞进行FCM的检测,结果表明,接受同种异体肾移植患者外周血标本中,部分患者术后3dIL-17+T细胞百分率较术前升高了约2倍(3.30%vs.1.66%),但术后7d时其频率则下降到与手术前相当水平(1.96%vs.1.66%),见图1｡

2.2 同种异体肾移植手术前､后患者血清C5a水平比较 对同种异体肾移植患者不同时相点血清中C5a水平进行ELISA检测,发现接受同种异体肾移植术后3d与手术前差异无统计学意义(P0.05);术后7d患者血清C5a水平较术前(即0h)显著上升[(182.00±7.08)ng/mLvs.(116.50±15.95)ng/mL,P0.01],见图2｡表明移植术后补体C5被激活裂解形成了C5a｡

2.3 不同肾脏组织中IL-17的表达与补体C5b-9沉积的比较正常肾组织和发生排斥反应肾组织的免疫组织化学染色结果表明,发生排斥反应移植肾组织中IL-17的表达(图3)和C5b-9的沉积(图4)较正常肾组织中明显增加:10例有排斥反应的患者肾组织IL-17表达均呈弱阳性,C5b-9的表达均呈强阳性;而5例无排斥反应的正常肾组织中IL-17表达则为阴性,C5b-9的表达则为弱阳性｡且二者表达方式相似,均主要表达于HK2细胞｡

图2 肾移植患者手术前､后血清C5a水平比较

图3 不同肾组织中IL-17的表达比较(×400)

图4 不同肾组织中C5b-9沉积的比较(×400)

图5 免疫细胞化学检测HK2细胞IL-17表达

2.4 重组C5a对HK2细胞IL-17表达的诱导作用 对HK2细胞进行C5a受体(C5aR)的细胞化学染色,结果证实该细胞可组成性地表达C5aR;再加入重组的C5a对HK2细胞进行培养,48h后收集细胞,通过免疫细胞化学和FCM分析IL-17的表达,结果发现C5a刺激后,HK2表达IL-17的水平明显上调(图5､6),表明C5a可通过与C5aR结合,直接作用于HK2细胞调节其IL-17的产生｡

图6 FCM检测C5a对HK2细胞IL-17表达的上调作用

3 讨 论

近年来,中国每年由于各种原因导致的肾衰竭新增患者约200万人,虽然肾移植是治疗终末期肾衰竭最理想的方法,但是,术后移植排斥已成为维持移植肾长期存活的主要障碍｡目前,针对器官移植术后的排斥反应,临床上采用的环孢素A和FK506等免疫抑制剂均是通过抑制整个T细胞群的活化和增殖来发挥作用,缺乏选择性,不良反应大[10]｡因此,进一步探讨移植排斥的发生机制以发展新的治疗方案已经迫在眉睫｡

移植排斥是一种炎症反应,促炎性细胞因子IL-17在加速移植排斥中的重要作用也已得到越来越多实验数据的支持｡Fábrega等[11]在同种异体肝移植模型中发现,发生急性排斥反应的小鼠血清中IL-17和IL-23显著升高;Crispim等[12]在针对肾移植患者的研究发现,移植后发生移植排斥的患者血清IL-17的水平显著高于未发生排斥反应的个体;IL-17在肾小管区可以通过细胞分裂素活化蛋白酶途径诱导IL-6､IL-8和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1),介导排斥反应[13]｡本研究发现,接受同种异体肾移植的患者,部分在接受移植术后,IL-17+T细胞的百分率较术前明显升高(图1),这可能是由于每对供体与受体主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)分子的相容性程度不一,因此临床手术前普适剂量的免疫抑制剂会导致个体的排异程度在早期出现差异｡随着临床免疫剂量和方案的调整,大多数患者IL-17+T细胞在术后7d恢复到手术前水平(图1)｡与之一致的是,在临床上通过病理学诊断已确定发生排斥反应的移植肾组织中HK2细胞IL-17的表达水平较正常肾组织有明显的增强,见图3｡

C5a与C5b均为补体C5活化后的裂解片段,但C5a存在于液相,不易在组织局部检测到,而C5b形成后会依次与补体C6､C7､C8､C9结合,形成终产物C5b-9沉积于细胞表面,所以检测C5b-9也可以间接反映C5a的产生｡这在炎症反应的启动和调节中起着关键作用｡在同种异基因移植术中,补体的激活主要发生在以下两种情况:(1)超急性排斥反应阶段,由于受者体内预先存在的抗移植抗原的抗体与移植抗原结合,激活了补体,一般发生在移植术后数分钟至数小时;(2)在急性排斥阶段,受者体内产生的抗体与移植抗原结合,导致补体激活,一般在移植术后7d左右出现｡由于现在已具备成熟的受者体内预存抗体的筛选手段,故前者在目前的临床中基本可以避免,因此,移植排斥导致的补体激活主要发生在急性排斥反应中｡本研究也发现,接受同种异体肾移植患者血清C5a水平在术后3d与术前差异无统计学意义(P0.05),但术后7d时显著升高(图2)｡此外,与移植排斥肾组织中HK2细胞IL-17水平的高表达类似,补体C5的另一裂解片段C5b-9沉积的主要部位也是在移植排斥肾组织的HK2细胞(图4),表明该部位为移植排斥导致补体活化的主要部位｡肾移植排斥反应中HK2细胞IL-17的产生与补体裂解片段C5a是否有着某种关联;有文献报道C5aR组成性表达于原代肾上管上皮细胞以及包括HK2在内的肾上管上皮细胞系[14-15]｡本研究的体外细胞培养实验发现,HK2细胞在接受重组C5a刺激后IL-17表达明显上调(图5､6),表明补体活化产物C5a可直接作用于HK2细胞诱导IL-17的产生,促进排斥反应｡

该研究为补体C5a在移植肾损伤中的作用有了新的见解,为补体抑制剂治疗移植相关疾病的使用提供了进一步的理论依据｡本研究的不足之处在于临床总样本量偏少,体外细胞实验中关于C5a/C5aR介导HK2细胞IL-17产生的信号通路有待进一步的探讨｡

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Regulation effect of complement C5a on interleukin-17 during renal allograft rejection*

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(,,,400042,)

ObjectiveTo investigate the expression of proinflammatory cytokine interleukin-17(IL-17)and complement cleavage fragment C5aand the regulation effect of C5aon the expression of IL-17during renal allograft rejection.MethodsThe frequency of IL-17+T cell in peripheral blood and the expression of IL-17in renal tubular epithelial cells(HK2)after C5astimulation in renal transplant recipients were measured by flow cytometry and the changes of serum C5alevel was detected by ELISA,respectively.Immunohistochemistry was applied to detect and compare the expression of IL-17and the deposition of C5b-9in normal renal tissues and renal tissues with allograft rejection.The difference of IL-17expression in HK2cells before and after the recombinant C5a stimulation was detected by immunocytochemistry.ResultsBoth the percentage of IL-17+T cells and serum C5alevels were significantly increased after the allogeneic renal transplantation.Compared with normal renal tissues,both the deposition of C5b-9and the IL-17expression in renal tissues with allograft rejection was remarkably up-regulated,which showed the positive correlation between them.The expression of IL-17in HK2was obviously up-regulated by the recombinant C5astimulation.ConclusionC5amay positively regulate the expression of IL-17by tubular epithelial cells during the renal allograft rejection.

complement C5a;interleukin-17;kidney transplantation;graft rejection

10.3969/j.issn.1671-8348.2014.11.018

A

1671-8348(2014)11-1331-04

* 基金项目:国家自然科学基金面上资助项目(81170695,81370846)｡

李蜀婧(1983-),技师,硕士研究生,主要从事移植免疫方面的研究｡△

,Tel:(023)68757941;E-mail:zhkq2000@sina.com｡

2013-11-28

2014-01-22)

论著•临床研究