股骨干骨折合并脑损伤后大鼠肺脏炎性介质与SP-A变化的实验研究

刘 钢，宋耀宗，于 晨，刘 佳，孙天胜※

(1.解放军医学院，北京 100853； 2.北京军区总医院骨科，北京 100700)

随着我国经济的发展，工业、交通事故及突发灾难导致的多发伤显著升高。多发伤中四肢损伤合并脑损伤占有相当大的比例，Probst等[1]回顾性调查显示，4849例多发创伤患者中合并脑损伤者达65%。急性肺损伤(acute lung injury,ALI)/成人呼吸窘迫综合征(adult respiratory distress syndrome,ARDS)是这类多发伤严重并发症及主要死亡原因。因此，在多发伤的救治中，预防肺脏并发症的发生、发展是降低致残、死亡的关键。目前尚没有文献从蛋白组学、炎症学说层面对不同创伤模型早期引起的ALI/ARDS进行同步研究。本实验在三种不同创伤模型中，对不同时点间肺组织肺表面活性蛋白A(surfactant protein-A,SP-A)和炎性介质进行定量分析，为正确认识多发伤后ALI/ARDS及选择合理手术时机提供参考资料。

1 材料与方法

1.1实验动物 SD雄性大鼠，购于军事医学科学院动物实验中心。SD雄性大鼠108只，体质量250～300 g，采用随机数字表法分为空白对照组(12只)、股骨干骨折组(32只)、脑损伤组(32只)、股骨干骨折合并脑损伤组(32只)。

1.2方法

1.2.1动物模型制备 脑损伤致伤方法:本实验采用改进的Feeney′s自由落体硬膜外撞击方法[2]，致重度脑损伤，记录打击时间。股骨干闭合骨折致伤方法:参照Einhorn动物骨折造模法支架理念，根据标准骨折模型制作方法[3-4]，致股骨干闭合骨折，记录打击时间。

1.2.2取材 分别于致伤后1、6、12、24 h取右肺脏下叶组织，于液氮中冻存。标本全部收集完毕后，于液氮中取出冻存肺组织100 mg放入研磨器中，加入1 mL Buffer裂解液于冰上裂解1 h,研磨。4 ℃离心10 min(16 000 r/min，离心半径10 cm)，取上清液分装于EP管中，-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3Western Blot检测SP-A相对量 蛋白定量法测定肺组织匀浆蛋白质浓度，调整样本浓度均匀一致。各组以聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(12%分离胶和4%浓缩胶)，通过半干转印法转移至聚偏二氟乙烯膜上，恒压23 V转膜45 min；PVDF膜经封闭液封闭1 h，加入一抗：SP-A一抗用TBST(Tris盐缓冲液+Tween+Nacl)缓冲液1∶1000稀释，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜4次，每次10 min；加入二抗(1∶1000稀释)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；超敏发光液化学发光，显影、定影、拍照；凝胶成像仪分析系统分析扫描灰度值，计算目的蛋白与β肌动蛋白灰度值的比值。

1.2.4酶联免疫吸附测定法检测炎性介质水平 取样本上清液，按照白细胞介素(interleukin,IL)6、IL-10和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA试剂盒说明书进行操作，检测IL-6、IL-10和TNF-α水平。

2 结 果

2.1Western Blot检测肺组织匀浆SP-A表达 创伤后，SP-A随损伤程度的不同发生显著变化,6 h时骨折组、脑损伤组、骨折合并脑损伤组SP-A水平与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；12 h时，骨折组和骨折合并脑损伤组均出现SP-A下降；24 h时，骨折组降至接近对照组，脑损伤组仍然持续升高，骨折合并脑损伤组降至对照组之下，差异有统计学意义(P<0.05)。骨折组6 h SP-A水平达高峰，12 h出现下降，至24 h时与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；脑损伤组均呈上升趋势，与对照组和骨折组比较差异有统计学意义(P<0.05)；骨折合并脑损伤组SP-A水平6 h达高峰，12 h出现下降，24 h降至对照组之下(P<0.05)(表1、图1)。

2.2ELISA检测各组肺组织炎性介质

2.2.1各组肺组织TNF-α水平的比较 三组创伤模型后TNF-α水平均升高，以骨折合并脑损伤组最高，6 h时骨折组、脑损伤组、骨折合并脑损伤组升高幅度最大，其中仍然以骨折合并脑损伤组最高，12 h、24 h出现下降趋势，但损伤程度较重的骨折合并脑损伤组TNF-α水平仍然显著高于其他两组(P<0.05)(表2)。

表1 各组不同时点间肺组织SP-A水平的比较 (ng/L)

SP-A：肺表面活性蛋白A

C：对照组；G：骨折组；N:脑损伤组；G+N:骨折合并脑损伤组；SP-A：肺表面活性蛋白；β-actin：肌动蛋白

图1各组不同时点间SP-A变化

表2 各组不同时点间肺组织TNF-α水平的比较 (ng/L)

TNF-α:肿瘤坏死因子α

2.2.2各组肺组织IL-6水平的比较 三组创伤模型后IL-6水平均升高，以骨折合并脑损伤组最高；6 h时骨折组、脑损伤组、骨折合并脑损伤组IL-6水平升至最高，之后出现下降趋势，但24 h脑损伤组和骨折合并脑损伤组又升高，骨折组在24 h时IL-6水平接近正常(P<0.05)；损伤程度较重的骨折合并脑损伤组L-6水平各时间点仍然显著高于骨折组、脑损伤组(P<0.05)(表3)。

表3 各组不同时点间肺组织IL-6水平的比较 (ng/L)

IL-6:白细胞介素6

2.2.3各组肺组织IL-10水平的比较 三组创伤模型后IL-10水平均升高，其中骨折合并脑损伤组IL-10水平最高，骨折合并脑损伤组与其他三组相比差异有统计学意义(P<0.05)。24 h时骨折组出现下降趋势，而脑损伤组和骨折合并脑损伤组仍然继续升高(P<0.05)(表4)。

表4 各组不同时点间肺组织IL-10水平的比较 (ng/L)

IL-10:白细胞介素10

3 讨 论

ARDS是ALI的严重形式，ARDS进一步发展即为呼吸衰竭。目前对于多发伤引起的ALI/ARDS的具体机制尚不清楚。多数研究认为，与创伤后炎症细胞因子分泌增强，引发一系列瀑布炎性反应过程，肺泡上皮细胞广泛破坏有关[5]。严重创伤后会发生全身炎症反应综合征,释放多种炎性介质，如TNF-α、IL-6等。TNF-α是炎性反应的始动因子和最重要内源性介质，导致IL-6、IL-10等释放,过量TNF-α等炎性因子在体内大量产生和释放会破坏机体免疫平衡，产生多种病理损伤，形成级联放大的瀑布样恶性循环，导致ALI/ARDS的发生、发展[6-7]。

肺泡表面活性物质系统异常亦是ALI发病的重要原因。肺泡表面活性物质是由肺泡Ⅱ型上皮细胞合成和分泌的脂质和蛋白复合物，能减少肺气液界面表面张力，提高肺泡稳定性和防止呼气相肺泡塌陷[8]。SP-A是最早发现并且是在肺泡Ⅱ型上皮细胞中强烈表达、信号最为丰富的蛋白，它是肺表面活性物质的重要组分之一，约占蛋白总量的50%以上，在调节磷脂代谢及局部免疫防御方面意义重大,是反映Ⅱ型细胞功能的早期指标，也是判断患者肺损伤程度和预后的指标[9]。肺损伤时肺泡表面活性物质继发性缺乏或灭活，尤其是其相关活性蛋白的改变，更促进肺损伤的发生、发展，形成恶性循环。

本实验中创伤后肺组织炎性介质TNF-α、IL-6、IL-10 水平明显升高，严重创伤后(股骨干骨折合并脑损伤组)炎性介质升高最明显，表明严重创伤后炎性反应激烈。创伤后各研究组SP-A水平发生显著变化，说明创伤后会引起SP-A代偿性增加，严重创伤发生失代偿时SP-A水平下降。

综上所述，创伤后肺脏组织出现炎性介质、SP-A水平改变，炎性介质及SP-A水平与创伤程度密切相关。严重创伤后发生了全身炎性反应综合征，产生了大量炎性介质，对肺脏组织造成损伤，造成SP-A失代偿性减少，进一步加重了肺损伤，导致ALI/ARDS发生、发展，是创伤后发生ALI/ARDS甚至呼吸衰竭的重要因素。

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