道地产区不同牛膝种群的遗传多样性分析

孔德政，张 伟，李 永

(1 河南农业大学 林学院，河南 郑州 450002； 2 信阳师范学院 生命科学学院，河南 信阳 464000)

牛膝(AchyranthesbidentataBl.)为苋科(Amaranthaceae)牛膝属(AchyranthesL.)多年生草本植物，是中医临床常用传统药材之一,以干燥根入药。其道地产区位于河南地区，产于河南的牛膝为怀牛膝，药效最好，是我国著名的四大怀药之一[1]。牛膝对多种疾病有很好的治疗效果，生牛膝可活血、通经，治产后腹痛、月经不调、闭经、难产、尿血、淋病、鼻衄、虚火牙痛、脚气水肿、喉痹、痈肿和跌打损伤；熟牛膝有补肝肾、强筋骨之功效，可治腰膝骨痛，四肢拘挛、萎痹、肝肾亏虚和跌打瘀痛。由于牛膝根的药用价值高且经济效益好，市场需求量逐年增加，但是牛膝的栽培面积较小，药材市场供不应求。在经济利益的驱使下，对野生牛膝的掠夺式采挖愈演愈烈，严重破坏了道地产区牛膝的野生资源，因此急需对其采取保护措施。

以往对牛膝的研究主要集中于其药理和生化方面[2-3]，对于牛膝遗传多样性和保护生物学方面的研究尚未见报道。因此，本试验以牛膝道地产区河南省境内的8个野生牛膝种群为对象，选用叶绿体基因片段psbA-trnH[4]对其种群的遗传变异情况进行分析，以期阐明其遗传多样性水平，为牛膝野生种群的保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取河南8个牛膝野生种群，每个种群随机采集6～10个个体，个体间距保持10 m以上，共采集68个个体，采样地信息见表1。采取牛膝当年萌发的新叶，放在保鲜袋中，用硅胶干燥，带回实验室后置于-70 ℃超低温冰箱中保存备用。

表 1 供试道地产区牛膝种群的基本信息

1.2 psbA-trnH基因的PCR扩增与测序

使用上海生工柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(SK8262)提取牛膝基因组DNA，操作流程按试剂盒说明书进行。用8 g/L琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的质量。

参考文献[4]，选用psbA-trnH片段的通用引物进行PCR扩增。PCR扩增反应在MJ Research PTC-200 PCR 仪(美国伯乐公司)上进行，扩增反应体系为30 μL，包括30 ng基因组DNA，10 mmol/L dNTPs(天根生化科技有限公司) 0.6 μL，10 μmol/L 通用引物[4]( 华大基因科技股份有限公司合成)0.9 μL，3 μLTaqBuffer和1 UTaq酶(天根生化科技有限公司)。PCR反应程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 8 min。PCR产物经试剂盒E.Z.N.A® Gel Extraction Kit (Omega Bio-Tek)纯化后送华大基因科技股份有限公司测序。将所得到的叶绿体基因psbA-trnH序列用ClustalX1.81[5]软件进行序列比对，并进行人工校正，然后适当地剪切使每条序列前后端对齐。

1.3 数据分析

采用DnaSP version4.0软件估算单倍型多样性指数(h)[6]和核苷酸多样性指数(π)[7]，评估道地产区8个牛膝野生种群的总体及种群遗传多样性，并用此软件估算种群间的基因流(Nm)与分化系数(Фst)。应用ARLEQUIN软件包(Version 3.1)中的分子变异分析AMOVA(Analysis of Molecular Variance)检测种群间和种群内的遗传变异组成。用Phylip软件对8个种群的遗传关系进行分析，计算出叶绿体基因核酸间的净差异[8]，采用邻接法(Neighbor-joining)构建严格一致性树。用TCS 软件进行单倍型的系统关系分析，构建网络树。应用IBD(Isolation-by-distance)软件分析牛膝种群平均遗传距离与地理距离(经纬度)之间的相关性，并进行1 000次重复的显著性检验。

对牛膝叶绿体基因片段进行Tajima’s D[9]和 Fu & Li’sD*、F*[10]检测，判断这些位点是否符合中性进化模式，以鉴定牛膝种群大小的历史变化。为了进一步验证牛膝的种群历史变化，假设种群恒定为零，进行失配分布分析(Mismatch distribution analysis)，以推测种群是否经历过扩张或瓶颈效应[8,11]。中性检验与失配分布分析均用DnaSP version4.0 软件进行。

2 结果与分析

2.1 不同牛膝种群的遗传多样性分析

试剂盒提取的DNA产物经电泳检测，条带清晰明亮，可以用于PCR扩增。

对68个牛膝个体叶绿体基因片段psbA-trnH进行PCR扩增和测序，获得了332 bp的目的片段，该片段存在5个碱基替代位点，有Ⅰ～Ⅵ 6个单倍型(表2)， 将其DNA序列提交至GenBank，依次获得JQ621856～JQ621861 6个登录号。由表3可见，单倍型Ⅰ个体数最多，有42个；单倍型Ⅱ、Ⅴ个体数最少，仅有3个。单倍型Ⅰ分布最广，存在于7个种群；单倍型Ⅳ次之，存在于4个种群；单倍型Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ分布范围较窄，只出现于1个种群。为了进一步阐明单倍型Ⅰ～Ⅵ的系统关系，本研究构建了单倍型的网络树，结果见图1。由图1可见，单倍型Ⅰ为祖先单倍型，位于网络树中间位置,与其他单倍型仅差一个突变步。对8个野生种群68个牛膝个体进行计算，其单倍型多样性指数为 0.594，核苷酸多样性指数为2.13×10-3。淮源牛膝种群(HY)的遗传多样性水平明显高于其他7个种群(表3)。

表2 不同牛膝种群叶绿体基因片段psbA-trnH位点变化产生的6个单倍型信息

表3 基于叶绿体基因psbA-trnH的不同牛膝种群的遗传多样性指数

2.2 不同牛膝种群的遗传进化关系

分子变异分析结果表明，8个种群间的遗传变异为49.07%，而种群内的遗传变异为50.93%，种群分化系数为0.499，表明牛膝的遗传变异在种群内与种群间大致相当，种群间分化水平稍低，种群间基因流较高(Nm=0.25)。由图2可以看出，九莲山种群(JL)与其他7个种群有较大分化，鸡公山种群(JG)、龙峪湾种群(LY)、大乘山种群(DC)和万仙山种群(WX)的亲缘关系最近。IBD分析检验表明，牛膝种群遗传距离与地理距离相关性较低(r=0.091)，不存在正相关关系(P>0.05)。

图1 基于叶绿体基因psbA-trnH的不同牛膝种群单倍型

2.3 不同牛膝种群的历史变化分析

对8个牛膝种群进行中性检验，Tajima’sD值为负值，但不显著(D=-0.734，P>0.10)；Fu & Li’sD*、F*均为正值，且均不显著(D*=1.070，P>0.10；F*=0.579，P>0.10)。失配分布分析结果(图3)同样支持牛膝种群没有快速增长，失配分布并未显著偏离种群恒定零假设(r=0.152，P=0.264)。结果表明，该片段符合中性进化模式，在整体水平上牛膝种群并未经历过瓶颈效应或快速扩张等历史事件。

图2 基于叶绿体基因psbA-trnH的不同牛膝种群进化关系的邻接树

3 讨 论

遗传多样性是生物所携带的遗传信息的总和，是物种长期进化的结果。一个种群遗传多样性越高或越丰富，其适应环境的能力就越强[11]。影响植物遗传多样性的因素很多，如地理分布范围、繁育系统、种群大小等[12]。异交和混交物种一般比自交物种有更高的遗传多样性，地理分布范围广的物种比分布范围狭窄的物种遗传多样性高，大种群比小种群的遗传多样性高[12-15]。

牛膝是广泛分布于中国暖温带及亚热带地区的多年生草本植物，种群规模很大，是以昆虫传粉为主的兼性传粉植物[16]，理论上而言应该具有较高的遗传多样性。本试验对道地产区河南牛膝种群的遗传多样性进行研究，结果发现，其遗传多样性(h=0.594)较Qiu等[17]研究的中国其他种子植物低(10个物种平均，h=0.817)。这可能是因为道地产区牛膝遭到大规模的采挖，种群数量有所下降；另一个原因可能是采样范围狭小，如果进一步扩大采样区域，其遗传多样性指数可能会上升。本研究结果显示，淮源种群(HY)牛膝的遗传多样性(h=0.806，π=3.68×10-3)明显高于其他7个种群，这可能与淮源种群受人为干扰程度较小有关。人为干扰很大程度上会造成种群隔离、生境破碎化，且对传粉者有较大的影响，从而增加了种群的近交系数，使种群有较高的遗传同源性，从而导致遗传多样性的丢失，最终形成干扰较多的地区牛膝种群遗传多样性较低的格局。

本研究结果表明，道地产区牛膝种群间有很低的遗传分化(ФST=0.499)。供试牛膝种群间基因流较高(Nm=0.25)，这可能是由于叶绿体基因由种子进行传播，而成熟的牛膝种子往往有刺状的小萼片宿存[17]，此类种子多靠动物进行传播，其传播距离较远，所以种群间基因流较高。牛膝九莲山种群(JL)与其他7个种群有较大分化，鸡公山种群(JG)、龙峪湾种群(LY)、大乘山种群(DC)和万仙山种群(WX)4个种群的亲缘关系最近，但这4个种群的地理距离反而相对较远。IBD分析也进一步证明, 遗传距离与地理距离相关性较低(r=0.091)，不存在正相关关系(P>0.05)。这可能是由于牛膝种子的结构特殊，使种子具有高效的传播效率，导致在小范围内种群遗传距离与地理距离之间相关性较低。

8个牛膝种群有6个单倍型(Ⅰ～Ⅵ)，单倍型Ⅰ与其他单倍型仅差一个突变步，亲缘关系相当。单倍型Ⅰ为祖先单倍型且分布最广，存在于7个种群，仅在九莲山种群(JL)未出现。一般来讲，亲缘关系近的单倍型在同一地区或种群中出现的概率较大，而JL种群是一个较为特殊的现象，其在道地产区中具有特殊的基因型，应该受到更多的保护。淮源种群(HY)的遗传多样性明显高于其他7个种群，且有特殊的单倍型Ⅱ和Ⅴ，也应该作为一个保护单元受到更多的重视。

总之，本研究结果表明，道地产区河南野生牛膝种群的遗传多样性相对较低；人类活动较多的地区可能会造成牛膝种群的遗传多样性降低；牛膝种群遗传距离与地理距离之间不存在正相关关系；淮源种群(HY)与九莲山种群(JL)应该作为保护单元受到更多的重视。

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