茶多酚对大鼠皮层神经元的保护作用研究

栗建新

茶多酚(tea polyphenols，TP)是从天然植物茶叶中分离提纯的30多种酚类化合物的复合体，约占茶叶干物质总量的20%～30%，包括儿茶素、黄烷双醇、类黄酮和酚酸四类物质。其中儿茶素是茶叶多酚类物质的主要成分，约占多酚类物质的80%，属黄烷醇类。茶多酚具有抗肿瘤、降血脂、降血压、降糖、抑菌、抗病毒等多种药理作用[1-4]。本研究采用体外培养的皮层神经元，酸环境介导损伤模型，观察茶多酚对体外培养皮层神经元损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1药品与材料 茶多酚(TP≥98%) (杭州怡倍嘉茶叶科技有限公司)；盐酸阿糖胞苷(上海华联制药有限公司，DMEM/F-12 HYCLONE公司)；胰蛋白酶干粉(美国Gibco公司)；胎牛血清(FCS)(杭州四季青生物工程材料有限公司)；0.1%多聚左旋赖氨酸(美国sigma公司)；过氧化氢(H2O2)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒和丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)。

1.2实验动物 清洁级新生24 h内SD大鼠，河南省实验动物中心提供。

1.3仪器设备 水套式二氧化碳孵箱(德国GmbH公司);722紫外分光光度(上海第三分析仪器);高速低温离心机(德国BECMAN产品)。

1.4大鼠皮层神经元的体外培养 取出生后24 h内的SD乳鼠，用无齿镊取两侧大脑皮层，放入盛有D-Hank’s液的培养皿中，轻轻剔除未去尽的脑膜后，用眼科剪倒碎脑组织1 mm3。然后加入 0.25%胰酶 37℃， 消化15 min，终止消化，离心去上清，加入适当的10%胎牛血清的DMEM/F12，用光滑的细口吸管轻轻吹打数次，用 200目的尼龙网过滤，以 1×106个/ml 的密度将细胞种植在预先放有包被多聚 L赖氨酸培养瓶中，置37℃，5%CO2的培养箱内培养，第2天加入10 μmol/L阿糖胞苷作用24 h后全部换液，以后每2天换液1次，每次换半量。培养6 d后NSE免疫细胞化学染色确定为神经元。

1.5酸性环境介导皮质神经元损伤模型建立及给药方式 取培养6 d的大鼠皮层神经元随机分为以下几组：①正常组；②酸环境损伤组；③TP高、中、低浓度组(80 mg/L、40 mg/L、20 mg/L)。正常对照组常规换液一次，其余各组细胞除去原培养液，用D-Hank’s液洗涤2遍，酸环境损伤组加入pH 6.0的低糖DMEM液，各给药组在酸环境损伤处理过程中分别加入含不同浓度TP低糖DMEM液，置细胞培养箱中37℃、5%CO2饱和湿度下培养1 h后，进行指标测定。

1.6生化指标测定 按照试剂盒说明，比色法测定上层培养液中过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA) 和乳酸脱氢酶(LDH)的含量。

2 结果

TP对大鼠皮层神经元经酸环境损伤后细胞培养液中H2O2、LDH和MDA的影响,研究结果显示，模型组与正常组比较，大鼠皮层神经元在培养液中的 H2O2、LDH和MDA释放明显增多(P< 0.01)；TP高、 中、 低各个剂量组对酸环境引起损伤的大鼠皮层神经元在培养液中H2O2、LDH和MDA释放量具有不同程度的降低作用，与模型组比较差异有统计学意义(P< 0.01)，见表1。

表1 TP对体外培养大鼠皮层神经元损伤时培养基中H2O2、LDH和MDA的影响

注：a，P<0.01 VS 正常组；b，P<0.01 VS 模型组

3 讨论

在脑缺血期时，由于氧供不足致使脑组织进行无氧的糖酵解，产物乳酸和ATP水解产物质子的积聚致缺血性组织周围的pH值显著下降，导致缺血区组织周围的pH值明显地从7.3降到6.0[5]，致使神经元损伤，神经元调往或死亡。H2O2作为体内的一种自由基，它的含量的高低也会直接反映体内过氧化水平的高低；LDH是无氧酵解中的一个关键酶，广泛存在于各种组织细胞中，正常情况下很少从胞浆中释放，病理情况时细胞膜通透性增高，LDH漏出增加，是细胞受损的一个敏感指标。因此，检测LDH的漏出量可反映细胞损伤的程度；自由基增加，氧自由基可使细胞膜上多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，引起对细胞的损害，脂质过氧化产物MDA，由于MDA是细胞内脂质过氧化反应的最终产物，化学性质稳定，且其含量能够体现组织细胞中氧自由基的含量。从本文实验结果看，酸性环境损伤1 h可使神经元培养液中H2O2、LDH和MDA含量显著增高，而TP可呈浓度依赖性的减少损伤所引起的H2O2、LDH和MDA含量，提示TP具有较强的抗氧化能力。以上指标从不同的方面证明了TP对皮层神经元的保护作用。

综上所述，TP对酸介导神经元损伤具有保护作用，其作用机制可能与清除自由基和抗氧化性有关。TP对神经细胞保护作用的其它机制，这尚需进一步研究。

[1] 宿迷菊,王岳飞,骆耀平，等.茶多酚抗炎作用研究进展.茶叶,2006,32(1):10-13.

[2] 林亲录，施兆朋，刘湘新，等.儿茶素和表儿茶素对动物血脂的影响.中国食品学报，2002，2(3):16-20.

[3] 胡秀芳,杨贤强，陈留记.茶多酚对皮肤的保护与治疗作用.福建茶叶,2000,12 (2): 44-45.

[4] 胡秀芳,杨贤强.茶儿茶素对癌细胞凋亡作用的研究.茶叶科学,2001,21(1):26-29.

[5] Hoffman WE, Charbel FT, Edelman G,et al. Brain tissue acid-base change during ischemia. Neurosurg Focus,1997,2(5):E2.