珍稀泌盐植物长叶红砂两个WRKY转录因子的克隆及表达分析

王佳，郑琳琳，顾天培，王学峰，王迎春＊

（1.内蒙古大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特010021；2.内蒙古和信园蒙草抗旱绿化股份有限公司，内蒙古 呼和浩特010021）

植物在生长发育过程中时刻遭受着各种生物和非生物胁迫，如病虫害、盐碱、干旱、低温等。为了适应复杂多变的环境，植物自身形成了一套复杂的胁迫应答机制，使其能够在不同环境中正常生长［1－3］。基于分子水平的胁迫应答信号转导在这一过程中起到了至关重要的作用，其中WRKY蛋白作为植物特有的转录因子超家族，具有瞬时性、多效性，广泛参与多种生物或非生物胁迫反应［4］，对探索植物的抗逆性具有重要价值［5］。

WRKY蛋白由于其N端高度保守的WRKYGQK氨基酸序列及其特殊的锌指结构而命名，根据WRKY结构域的数量和锌指结构的不同，可将WRKY转录因子分为三大类：I类通常含有2个WRKY结构域；II类含有1个WRKY结构域，锌指结构为Cx4－5Cx22－23HxH型；III类含有1个WRKY结构域，锌指结构为Cx7Cx23HxC型［6］。WRKY转录因子首先在甘薯（Ipomoeabatatas）中发现，随后在野生燕麦（Avenasativa）、皱叶欧芹（Petroselinumcrispum）、拟南芥（Arabidopsisthaliana）等植物中得到克隆和鉴定［7－10］。目前WRKY转录因子家族成员在拟南芥、水稻（Oryzasativa）、毛果杨（Populustrichocarpa）等［11－13］植物中的成员数分别为74，102，104个。植物体内的WRKY转录因子在植物生长发育及对外界环境的适应中发挥了重要的调控作用［14］。Dong等［15］采用Northern blotting方法，发现拟南芥49个WRKY转录因子的表达与多种环境因素（低温、干旱、植物激素、机械损伤、病原体）有关。仇玉萍等［16］从4℃胁迫的水稻植株cDNA文库中获得了13个WRKY基因全长，其中10个基因的表达受到NaCl、PEG（聚乙二醇，polyethylene glycol）、低温（4℃）和高温（42℃）等非生物逆境因子的胁迫影响。Xie等［17］用外源激素ABA（脱落酸，abscisic acid）和GA（赤霉素，gibberellin）处理水稻叶片发现OsWRKY71的表达量显著升高。目前对WRKY转录因子的相关研究主要集中在拟南芥等模式植物中，而自然界中许多野生植物在抵抗各种生物和非生物胁迫的表现更为突出，因此加强对野生植物资源的相关研究，获得优质抗性基因具有非常重要的意义。

长叶红砂（Reaumuriatrigyna），属于柽柳科（Tamaricaceae）琵琶柴属（Reaumuria），又名黄花红砂、黄花琵琶柴，起源于第三纪，为古地中海孑遗植物，所以被称为“活化石”，被列为内蒙古自治区重点保护植物，是荒漠草原和干草原地区的重要生态屏障和良好草场［18］。石蜡切片和扫描电镜观察发现，长叶红砂叶和幼茎上均布有盐腺，其盐腺结构对于适应盐渍环境具有重要作用［19］。同时发现其气孔下陷，具有孔下室，体积较盐腺小；其保卫细胞细胞壁明显加厚，可有效抑制叶片水分的蒸发；表皮内栅栏组织发达，海绵组织退化，中央维管束周围具有大型储水细胞［20］，因此长叶红砂对盐碱和干旱等极端环境具有极强的适应性，开展长叶红砂WRKY33转录因子作用机制研究，将为进一步探索该植物抗逆分子调控机制奠定基础。本实验室利用Illumina测序技术对正常生长和盐胁迫的长叶红砂进行转录组测序［21］，获得了该植物的大量遗传信息，通过数据分析发现64694条Unigenes在盐胁迫后的表达量发生了变化，其中67条Unigene片段属于WRKY转录因子家族。本研究选取两个注释为WRKY转录因子且在盐处理后表达上调明显的两个基因片段（Unigene30408和Unigene14081），采用RACE技术克隆获得了这两个WRKY转录因子的全长序列，并利用半定量RT－PCR技术研究了其表达特性。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所用长叶红砂种子于2009年9月采自中国内蒙古自治区东阿拉善－西鄂尔多斯地区（106°27′～111°28′E，39°13′～40°52′N，海拔1500～2100m），种子采回后于室外晾干，室温下贮藏备用。

RNA提取试剂盒（Plant Plus RNA Regent）购自北京天根生化科技有限公司；Taq DNA聚合酶、DNase I、RNase inhibitor、pMD19－T载体及DNA Marker购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；反转录试剂盒为Invitrogen公司的M－MLV Reverse Transcriptase Kit；cDNA全长扩增使用Clontech公司的SMARTTMRACEcDNA Amplification Kit；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；其他试剂均为进口分装或国产分析纯。PCR引物合成及测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 植物培养和胁迫处理 挑选籽粒饱满的长叶红砂种子，10%次氯酸钠浸泡15min，灭菌水冲洗3～5遍，播种于装有30mL MS（Murashige and Skoog）培养基的150mL三角瓶中。暗培养3d后，置于25℃、湿度70%、16h/8h光照/黑暗的条件下培养。待幼苗生长至10cm左右，将其转移至约装有30mL 1/2Hoagland营养液的大试管中，在相同条件下继续培养，期间每隔3d更换一次营养液。

待幼苗长至20cm左右时选取长势一致的幼苗，分别用30%PEG6000、100mmol/L NaCl、10μmol/L ABA及4℃处理0，1，3，6，12和24h，植物材料采集后用液氮速冻，存于－80℃备用。

1.2.2 RNA提取和cDNA合成 长叶红砂总RNA的提取参照天根Plant Plus RNA Reagent说明书进行。所提总RNA在37℃下用RNase－free DNase I处理1h去除残余DNA。用Nanovue plus微量紫外分光光度计检测其浓度和质量，1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

RACE所用cDNA合成参照Clontech公司的SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit说明书进行；半定量cDNA合成参照Invitrogen公司的M－MLV Reverse Transcriptase Kit说明书进行。

1.2.3 长叶红砂两个WRKY基因全长cDNA序列的扩增 根据长叶红砂高通量测序结果功能注释为WRKY转录因子（Unigene30408和Unigene14081）的DNA序列，参照Clontech公司的SMARTTMRACE cDNA Amplification试剂盒要求设计RACE引物（表1）。以长叶红砂cDNA为模板，结合试剂盒内提供的锚定引物进行目的基因3′和5′末端的扩增。第一轮PCR反应体系为25μL，包含2mmol/L Mg2＋、10mmol/L dNTPs、锚定引物10xUPM（试剂盒提供）2.5μmol/L、特异性引物 GSP5或 GSP3 0.5μmol/L，Taq DNA 聚合酶1.0U，模板cDNA 20ng。PCR扩增程序为95℃预变性5min；94℃变性30s，72℃延伸2min，循环5次；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸2min，循环5次；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸2min，循环25次，72℃延伸10min。选取第一轮PCR产物分别稀释10，50，100倍，以1μL为模板，引物使用巢式引物NGSP5或NGSP3，进行巢式PCR，PCR体系和条件同上。巢式PCR产物经切胶回收、连接至PMD－19T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，鉴定后进行测序。测序结果用vector NTI 11.5软件拼接在一起，得到基因全长cDNA序列。

1.2.4RtWRKY33－1和RtWRKY33－2基因的生物信息学分析 利用NCBI的ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）识别开放阅读框序列并翻译推测出氨基酸序列；利用Ex－PASy数据库（http：//www.expasy.org）的 Prot－Param软件分析蛋白的理论分子量和等电点，利用SOPMA软件对蛋白质二级结构进行预测［22］；蛋白序列比对用ClustalW软件执行；系统进化树用MEGA 5.05软件，邻接法（neighbor－joining，N－J法）绘制系统进化树。

1.2.5 半定量RT－PCR表达分析 根据两个基因的编码序列和长叶红砂β－actin序列信息设计用于半定量RT－PCR分析的特异引物及内参基因引物（表1）。PCR反应体系为25μL，内含2mmol/L Mg2＋、200μmol/L dNTPs、引物各1.0μmol/L，Taq DNA 聚合酶1.0U，20ng模板cDNA。PCR反应程序为94℃预变性1min，94℃变性20s、55℃退火30s、72℃延伸30s，28个循环，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离观察。重复3次，通过比较目的条带的亮度以判定基因表达的强弱。

表1 实验所用的引物列表Table 1 Primer sequences was used in this study

2 结果与分析

2.1 基因全长的克隆

图1 RACE－PCR产物凝胶电泳图Fig.1 Products of RACE－PCR

根据长叶红砂录组数据中两个功能注释为WRKY转录因子的基因序列（Unigene30408和Unigene14081）设计引物，利用RACE技术分别获得两个基因的3′和5′末端（图1），利用vector NTI 11.5软件将测序结果拼接获得两个分别为2163和2145bp的全长cDNA序列（GenBank登录号分别为KF421158和KF421159），通过ORF finder软件预测开放阅读框分别为1681和1776bp，分别编码573和591个氨基酸，在NCBI数据库中比对发现这两个基因与拟南芥AtWRKY33的同源相似度分别为79%和87%，因此将这两个基因命名为Rt－WRKY33－1和RtWRKY33－2。

2.2 RtWRKY33－1和RtWRKY33－2的生物信息学分析

氨基酸序列分析显示，这两个基因均具有两个典型的WRKYGQK保守结构域，属于I类WRKY转录因子（图2）。其中RtWRKY33－1蛋白相对分子量62.85kDa，等电点为5.51。

图2 10种植物WRKY33氨基酸比对Fig.2 Comparison of the amino acid sequences of WRKY33in ten plants

氨基酸比对分析表明同源性最高的为大豆（XP003544908）、黄瓜（XP004137368）和野草莓（XP004294758），同源性均为97%；其次为拟南芥（AAM34736）和琴叶拟南芥（XP002879748），同源性均为79%，以及葡萄（XP002272040），同源性为78%；同源性较低的为二穗短柄草（XP003577478）和乌拉尔图小麦（EMS64237），分别为68%和58%。

RtWRKY33－2蛋白相对分子量65.11kDa，等电点为6.48。氨基酸比对分析表明，同源性最高的为欧洲油菜（ACI14397），为91%；其次为大豆（XP003544908）、拟南芥（AAM34736）、野草莓（XP004294758）、黄瓜（XP004137368）和琴叶拟南芥（XP002879748），分别为88%，87%，86%，80%和79%。

蛋白二级结构预测结果表明，RtWRKY33－1蛋白（图3A）的573个氨基酸中，473个为随机卷曲，占76.27%；66个为α螺旋，占11.52%；57个为延伸链，占9.95%；13个为β转角，占2.27%。RtWRKY33－2蛋白（图3B）的591个氨基酸中，429个为随机卷曲，占72.59%；73个为α螺旋，占12.35%；65个为延伸链，占11%；24个为β转角，占4.06%。

对这两个基因编码蛋白的二级结构比对可以发现其保守结构域随机卷曲、α螺旋、β转角和延伸链的构成差异不大。然而在N末端（1～80aa之间）两个蛋白中延伸链的数目相差虽然不大，出现位置却存在很大差异，同时α螺旋和β转角的数目和位置差异明显；第1个WRKY结构域之前（190～240aa之间）RtWRKY33－1的随机卷曲中夹杂着7个α螺旋，而RtWRKY33－2中没有；在两个 WRKY结构域之间（430～450aa之间）Rt－WRKY33－1有3个延伸链，而RtWRKY33－2中全部为随机卷曲。

系统进化树分析显示（图4），长叶红砂的两个WRKY33转录因子与十字花科的琴叶拟南芥、拟南芥、荠菜和欧洲油菜亲缘关系较近，与葫芦科的黄瓜、葡萄科的葡萄、蔷薇科的野草莓及豆科的大豆亲缘关系次之，与禾本科的单子叶植物二穗短柄草、节节麦和乌拉尔图小麦亲缘关系较远。

图3 RtWRKY33蛋白质二级结构预测Fig.3 Prediction of the secondary structure of RtWRKY33

图4 12种植物WRKY33氨基酸系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of WRKY33from ten plants

2.3 RtWRKY33－1和RtWRKY33－2基因的表达特性分析

通过半定量RT－PCR技术对两个基因进行表达分析发现，这两个基因均受盐（NaCl）、冷（4℃）、干旱（PEG）和ABA四种非生物胁迫的诱导（图5）。RtWRKY33－1在盐和冷胁迫下的表达趋势基本一致（图5A），处理1h后开始表达，3和6h基本不表达，在12和24h后表达量又升高，但低温处理12h后对其诱导更明显；在干旱胁迫下均有上调表达，呈现先升高后降低的趋势，在6h时表达量最高；在添加外源激素ABA的情况下均有表达，其表达呈现出先升高后降低然后又升高的趋势。

RtWRKY33－2在盐、冷胁迫下均有明显上调表达（图5B），其表达呈现先升高后降低然后又升高的趋势，在6 h表达量最低；干旱胁迫下持续表达，在1h表达最高，其后表达基本不变；施加外源激素ABA对其诱导明显，开始1～12h阶段表达量均比较高，但在24h后表达量迅速下降，基本不表达。

通过对比两个基因之间的表达趋势分析发现，在盐和冷胁迫下RtWRKY33－2基因持续表达且上调明显而RtWRKY33－1在3和6h基本不表达，因此盐和冷对RtWRKY33－2的诱导更明显；在干旱胁迫下两个基因均持续表达，但RtWRKY33－1在6h表达量最高，而RtWRKY33－2在1h表达量最高；在施加外源激素ABA的条件下表达趋势差异明显，RtWRKY33－2处理24h后基本不表达，而RtWRKY33－1表达量虽然比较低，但是一直持续表达。

图5 RtWRKY33基因在不同胁迫处理下的表达分析Fig.5 Analysis of RtWRKY33gene expression in different stress

3 讨论

植物体内的WRKY转录因子参与多种生理生化反应，在高盐、低温、干旱等非生物胁迫及ABA响应信号转导通路中有重要作用［23－24］。付乾堂和余迪求［25］采用 Northern blotting的方法，发现拟南芥 AtWRKY25、At－WRKY26和AtWRKY33转录因子受多种非生物胁迫因素的影响，其中低温和高盐对这3个转录因子的诱导尤为明显。Jiang和Deyholos［26］对 NaCl胁迫下的拟南芥研究发现单突变体WRKY33和双突变体WRKY25WRKY33能够提高植株对NaCl的抗性。Li等［27］对WRKY25、WRKY26和WRKY33的拟南芥突变体和过表达拟南芥植株在高温胁迫下的研究发现，这3个转录因子在受乙烯激活的和热激蛋白相关的信号通路中协同调节拟南芥对高温的胁迫应答。因此WRKY33转录因子在拟南芥抵御非生物胁迫反应中发挥了重要作用。本研究中克隆到的长叶红砂两个WRKY33转录因子在4种非生物胁迫下均被诱导表达，但是盐、冷和ABA对RtWRKY33－2诱导尤为明显，同时RtWRKY33－2对干旱胁迫的响应更快，因此这两个基因在长叶红砂抵御非生物胁迫的应答反应中发挥的作用可能不同。

蛋白质的一级结构中氨基酸的序列决定了高级结构，高级结构决定了蛋白质的功能，而其中的随机卷曲经常构成蛋白质活性部位和特异功能部位［28］。植物中的谷胱甘肽转移酶（glutathione S－transferase，GST）是一类具有多种生理功能的蛋白质超家族，三维结构比较显示，虽然所有植物的GST比较保守［29］，但是在主要负责结合特异性底物的C末端结构域有较大变异，不同的GST能结合特定底物而发挥不同的生理功能［30］。通过生物信息学分析我们发现RtWRKY33－1与RtWRKY33－2的一级结构和二级结构在WRKY结构域的氨基酸序列和结构特性的相似性较高，但是在非保守结构域部分，尤其是N末端（1～80aa之间）、第1个WRKY结构域之前（190～240aa之间）和两个WRKY结构域之间（430～450aa之间）等位置的差异明显，可能对两个基因功能有一定影响。这种差异是否会引起蛋白活性部位的空间结构发生变化，从而使结合底物的特异性发生改变，还需要进一步的理论分析和实验验证。

本研究克隆了长叶红砂中两个WRKY33转录因子，并对其进行了生物信息学分析与逆境胁迫下表达模式的初步探索，为长叶红砂中研究WRKY33转录因子的功能和响应逆境应答的调控机制奠定了基础。后续我们将对这两个基因的拷贝数进行研究，并构建植物表达载体，导入模式植物拟南芥，探索其在转基因植株中的功能差异，为将来应用泌盐植物长叶红砂的WRKY33基因提高作物及牧草抗性提供参考。

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