苹果渣中多酚的提取及抗氧化性研究

王 伟

(陕西理工学院 化学与环境科学学院， 陕西 汉中 723000)

0 引 言

中国已经成为世界上最大的苹果生产国，2012年苹果产量达到3 800万吨，占世界苹果总产量的63.3%[1]。随着苹果果汁加工业的进一步发展，必然产生越来越多的果渣。我国每年排出的鲜苹果渣达100多万吨，大部分被废弃[2]，但是苹果渣中含有丰富的营养物质，如多酚[3-5]、果胶、多糖、膳食纤维素和一些微量元素[6]。

苹果多酚主要成分分为单环酚酸(对羟基苯甲酸和对羟基肉桂酸衍生物)、黄烷-3-醇类和原花色素类化合物(缩和型单宁类)、黄酮醇类化合物、二氢查尔酮和花色苷等多类化合物[7]，其中缩合型单宁类约占总酚化合物总量的50%[8]。苹果多酚的组分分布、含量因苹果的品种、种植条件、成熟度等的不同而表现出较大的差异性[9]。成熟苹果的多酚类主要为绿原酸、儿茶素和原花青素等[10]。苹果多酚在预防人类的慢性疾病，如癌症、心血管混乱、糖尿病等方面起着重要的作用[6]。植物多酚能够有效地抑制肉类中脂肪和蛋白质的氧化[11]。因此，深入研究苹果中多酚提取及其生物活性具有非常重要的意义。

本文以苹果渣为原料，乙醇为提取剂，采用超声波辅助提取苹果多酚，通过单因素试验、正交试验，对提取工艺进行优化，然后用提取的多酚进行抗氧化性试验。

1 试验过程

1.1 试剂与仪器

乙醇、没食子酸、2,6-二叔丁基对甲苯酚(Butylated hydroxytoluen，缩写BHT)、乙酸、三氯甲烷、碘化钾、硫代硫酸钠、磷酸、钨酸钠、钼酸钠、盐酸、淀粉(玉米)、硫酸锂和溴素均为分析纯。蒸馏水自制。富士苹果、猪油、芝麻油均购于汉中市集贸市场。

九阳原汁机(JYZ-E7)，九阳股份有限公司；电热恒温鼓风干燥箱(DUG-90304)，上海精宏实验设备有限公司；粉碎机(FE177)，天津市泰斯仪器有限公司；电子天平(AL204-IC)，梅特勒-托利多仪器有限公司；超声波清洗器(KQ3200E)，昆山市超声仪器有限公司；低速离心机(LD5-10)，北京京立离心机有限公司；旋转蒸发器(RE-2000A)，上海亚荣生化仪器厂；电热鼓风恒温干燥箱(DGG-9140B)，上海森信实验仪器有限公司；紫外分光光度计(CARY-50)，美国瓦里安公司；循环水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ))，巩义予华仪器有限责任公司。

1.2 工艺路线

苹果渣多酚的提取工艺流程图如图1所示，选用富士苹果、清洗、切块，用榨汁机进行压榨榨汁得到苹果汁和苹果渣，苹果渣粉碎，加入溶剂进行超声提取，提取液浓缩得到苹果渣多酚样，然后对其含量进行测定和抗氧化性试验。

图1 苹果渣多酚提取工艺流程图

1.3 苹果多酚含量的测定

1.3.1 溶液的配制

(1)没食子酸标准溶液：称取0.100 0 g没食子酸，体积分数70%的乙醇溶解并定容到100 mL容量瓶中，浓度为1.000 0 mg/mL，用移液管移去1.0 mL定容至10 mL容量瓶，浓度为100.0 μg/mL。

(2)Folin-Ciocalteu(F-C)试剂的配制参考文献[12]。

(3)吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL没食子酸标准溶液于7个10 mL的容量瓶中，分别加入2.0 mL F-C试剂，充分振荡后加入2.0 mL质量分数10%的Na2CO3溶液，摇匀并用蒸馏水定容至10 mL，在25 ℃恒温水浴中反应2 h，浓度分别为0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL。

1.3.2 苹果渣多酚的提取

称取1.0 g苹果渣于锥形瓶中，加15 mL体积分数60%的乙醇溶液，40 ℃水浴超声波辅助提取2次，每次30 min，合并提取液，过滤减压浓缩，用体积分数60%的乙醇溶液定容于50 mL容量瓶，待用。

1.4 抗氧化活性研究

1.4.1 油脂过氧化值的测定

称取芝麻油、猪油各50.0 g放入广口瓶中，按油重的0.02%计算BHT和苹果多酚用量，称取后溶于1 mL无水乙醇中，然后把乙醇溶液加入瓶中，充分搅拌均匀，置入(60±1)℃电热恒温培养箱中，强化保存，定期取样参照GB/T5538-2005《油脂过氧化值测定》测芝麻油、猪油的过氧化值(POV值)。

1.4.2 对油脂的抗氧化性能研究

称取1.4.1中2.0 g油样，放入具塞锥形瓶中，加入10 mL三氯甲烷、15 mL乙酸和1 mL饱和碘化钾溶液，迅速盖好瓶塞，混匀1 min，避光静置5 min。然后加入75 mL蒸馏水，以0.5 %淀粉液为指示剂加入1 mL，用0.1 mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定，直到蓝色消失，计算油样的过氧化值，计算对油脂氧化的抑制率。

2 结果与分析

2.1 吸收波长的选择

多酚类化合物分子上有极易氧化的羟基，在碱性条件下与F-C试剂反应后显色。显色液置于紫外-可见分光光度计中，波长在420～800 nm范围内扫描。没食子酸标准溶液的紫外-可见吸收光谱图见图2。从图2中可以看出，没食子酸标准溶液的最大吸收波长为765 nm。

2.2 测定多酚的工作曲线

按照1.3.1方法配制的没食子酸标准溶液，同时做空白，在765 nm下测定吸光度，以没食子酸溶液的吸光度为纵坐标、没食子酸浓度为横坐标进行线性回归，相关曲线如图3所示。

图2 紫外-可见吸收光谱图 图3 没食子酸浓度与吸光度相关曲线

从图3可以看出，没食子酸浓度在0～10 μg/mL范围内与吸光度值有良好的线性关系，线性方程为：y=0.115 5x+0.000 6，相关系数R2=0.999 7。表明Folin-Ciocalteu比色法能快速、准确地测定多酚含量。

2.3 超声波辅助提取苹果多酚工艺研究

称取1 000.0 g富士苹果经榨汁机榨汁分离得到740.0 g苹果汁和255.0 g苹果渣。分别对苹果渣的提取参数——乙醇体积分数、液料比、提取温度和提取时间进行单因素试验。

2.3.1 乙醇体积分数对苹果多酚提取率的影响

从文献中了解到甲醇、丙酮都有良好的提取效果，但二者毒性都比较大，因此本试验选用乙醇作为提取剂，考察不同乙醇体积分数对多酚提取率的影响。分别称取1.0 g苹果渣于5个比色管中，分别加入10 mL体积分数40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，在40 ℃超声波提取20 min，提取完毕过滤定容至50 mL的容量瓶中测定，结果如图4所示。

从图4可以看出：在乙醇浓度较低的情况下，苹果多酚提取率随着乙醇浓度的增加而逐渐增加；当乙醇体积分数达到60%时，苹果多酚提取率最高2.622 1 mg/g；当乙醇体积分数超过60%并增加时，多酚得率却逐渐开始下降。可能是乙醇浓度的增大从苹果渣中提取出来的杂质增大，导致多酚类提取率减少。所以最佳乙醇体积分数为60%。

2.3.2 料液比对多酚提取率的影响

分别取苹果渣1.0 g，加入体积分数60%的乙醇，在温度40 ℃下，超声提取时间20 min，选择液料比(单位为mL∶g)分别为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1对多酚提取率的影响，其结果如图5所示。

图4 乙醇体积分数对提取率的影响 图5 液料比对提取率的影响

由图5可以看出，多酚提取率随着液料比的增加呈先增大后减小的趋势，当液料比15(mL)∶1(g)时达到最大值2.654 5 mg/g，以后逐渐下降。可能是由于提取剂的增加导致苹果渣中杂质增多。因此吸光度下降，最佳液料比为15(mL)∶1(g)。

2.3.3 温度对多酚提取率的影响

分别称取苹果渣1.0 g，加入15 mL体积分数60%的乙醇，在20、30、40、50、60、70 ℃提取20 min，提取完毕过滤定容至50 mL的容量瓶中测定，结果如图6所示。

由图6可知，随着温度的升高多酚提取率在逐渐增加，40 ℃时达到最大值2.621 2 mg/g，以后随着温度的增加而减小。由于随着温度的升高乙醇杂质的溶解性增大，多酚容易在温度较高时变质等，最佳提取温度为40 ℃。

2.3.4 提取时间对多酚提取率的影响

分别称取苹果渣1.0 g，加入15 mL体积分数60%的乙醇，在温度40 ℃分别提取10、20、30、40、50、60 min，提取完毕过滤定容至50 mL的容量瓶中测定，结果如图7所示。

图6 温度对提取率的影响 图7 提取时间对提取率的影响

从图7可以看出，随着提取时间的增长多酚提取率呈先增大后减小的趋势，在40 min时多酚提取率达到最大值2.664 2 mg/g，最佳提取时间为40 min。

2.4 正交试验优化最佳工艺条件

在单因素试验的基础上，通过正交试验选择最佳工艺条件，提取因素为乙醇浓度、液料体积质量比、提取时间和提取温度，分别选择三个水平，因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表

由四因素三水平生成的正交表L9(34)及试验提取结果如表2所示。

表2 L9(34)的正交试验设计

续表

由表2可以看出，乙醇浓度对提取结果有较大的影响，其次是液料比，随后是提取时间，影响最小的因素是提取温度。即影响苹果多酚提取因素的影响顺序为A﹥B﹥C﹥D，试验采用最佳因素水平组合为A2B2C2D1，即乙醇体积分数60%、料液比15(mL)∶1(g)、超声时间40 min、温度30 ℃。在此条件下进行验证试验，苹果多酚提取率为2.760 6 mg/g。

2.5 苹果多酚对油脂抗氧化性能研究

2.5.1 对芝麻油的抗氧化作用

油脂抗氧化剂分为天然及人工合成两大类，虽然人工合成在价格等方面占有一定优势，但随着安全性问题的提出，对天然抗氧化剂的研究开发越来越受到人们的重视，从天然产物中寻找抗氧化剂已成为一种趋势。本试验分别用苹果多酚和BHT对芝麻油进行处理，结果如图8所示。

可见，苹果多酚和BHT对芝麻油的氧化具有明显的抑制作用。且随着贮藏时间的增加，抗氧化能力越明显，第十天时苹果多酚和BHT对芝麻油氧化的抑制率分别为38.44%和33.06%，苹果多酚比BHT对芝麻油氧化的抑制效果更好。

2.5.2 对猪油的抗氧化作用

本试验分别用提取多酚和BHT处理猪油，并在(60±1)℃恒温培养定期取样测其POV值，结果如图9所示。

图8 苹果多酚与BHT分别 图9 苹果多酚与BHT分别 对芝麻油的抗氧化作用 对猪油的抗氧化作用

从图9可以看出，苹果多酚和BHT对猪油均具有较好的抗氧化作用，其抑制率随时间的增加而增强。第十二天时苹果多酚和BHT对猪油氧化的抑制率分别为44.93%和35.62%，苹果多酚比BHT对猪油氧化的抑制效果更好。

通过苹果多酚对芝麻油和猪油的抗氧化性试验，表明苹果多酚有良好的抗氧化活性。

3 结 论

采用超声波法提取苹果渣中的多酚物质，不仅可以缩短提取时间，而且可以在低温条件下降低能耗。通过正交试验优化，确定超声辅助提取苹果渣中苹果多酚的最优工艺条件为：乙醇体积分数60%、液料比15(mL)∶1(g)、提取时间40 min、提取温度30 ℃，在此条件下苹果多酚提取率为2.760 6 mg/g。

苹果多酚提取物的抗氧化试验研究表明，苹果多酚具有很好的抗氧化能力。本工作对苹果渣的开发利用具有一定的指导意义。

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