柞蚕Septin基因的克隆及表达分析

王 磊, 刘栋然, 苏琳瑛, 刘朝良

(安徽农业大学 生命科学学院， 合肥 230036)

Septin蛋白分子量在30～65 kD之间，都含有保守的GTP结合蛋白结构域的蛋白家族，最早在1971年通过筛选出芽酵母突变体而发现的[1]。后来septin陆续在线虫[2]、果蝇[3]、哺乳动物[4]中发现，但在原生生物和植物基因组信息中未发现它的存在。其中，septin在酵母、果蝇以及人中的研究较多，功能也较明确。酵母中有7个septin，已证实其参与了酵母胞质分裂过程、膜分割区的界限设定(compartmentalization)、囊泡运输及分泌过程、有丝分裂纺锤体的定向等过程[5]。果蝇中有5个septin，主要调节细胞质分裂及分裂末期卵裂沟的迁移过程，并且septin蛋白之间形成复合物具有结合和水解GTP的活性[6]。在人类基因组信息中鉴定了13个septin基因，分为4个亚家族，并且有变异剪接现象。人septin蛋白的功能多样，不仅体现在参与了细胞内物质的运输与分泌(包括调节神经递质与血小板的释放反应等)过程，而且已明确了septin家族与Parkinson病、Alzheimer病、Down′s综合征等神经系统疾病，白血病及中枢神经系统肿瘤、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌等肿瘤，志贺(氏)杆菌和立克次氏体之类的病毒和细菌在内的病原体感染，男性不孕症以及遗传性神经肌肉萎缩(HNA)等疾病发生有关[3]。

柞蚕(AntheraeapernyiGuerin-Meneville)是鳞翅目大蚕蛾科柞蚕属的一种野外放养的经济昆虫，以柞树(Xylosmaracemosum)叶为食料，茧可缫丝，蛹可食用或药用，具有重要的经济价值。柞蚕主要分布在中国辽宁、河南及山东等省，在朝鲜、韩国、俄罗斯、乌克兰、印度和日本等国亦有少量分布。由于柞蚕具有体型大，饲养容易等特点，对柞蚕进行了大量的转基因柞蚕研究及利用柞蚕进行生物反应器来表达外源蛋白等研究具有很好的前景[7]。本研究利用前期柞蚕cDNA文库获得的柞蚕septin基因部分片段，设计RACE引物克隆了柞蚕septin基因全长，对序列进行了生物信息学分析，并研究了该基因在不同组织中的表达情况，也利用大肠杆菌对柞蚕septin进行了体外原核表达，为进一步研究septin蛋白功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试柞蚕品种为 “克青”。4月初幼虫孵化后用新鲜的麻栎(Quercusacutissima)叶在室温下饲喂，1～3龄小蚕期采用塑料袋育，4～5龄大蚕期采用插枝育[8]。

1.2 总RNA提取

总RNA提取按照Trizol法进行。柞蚕脂肪体及其他组织样品在研钵中加入液氮磨碎，按照Trizol试剂说明书提取。提取后总RNA利用微量核酸定量仪(NanoDrop 1000 Spectrophotometer)检测RNA的纯度和浓度。

1.3 ApSeptin基因的扩增

根据柞蚕cDNA文库测序获得的柞蚕ApSeptin基因部分片段的序列信息，利用Primer 5软件设计ApSeptin基因特异的3′-RACE和5′-RACE引物(表1)。根据TaKaRa公司产品5′-Full RACE Kit和3′-Full RACE Core按照说明书分别制备第一链cDNA用于扩增ApSeptin3′端和5′端序列。5′-RACE PCR反应程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s, 62 ℃退火40 s； 72 ℃延伸120 s，共34个循环，接着72 ℃延伸10 min。3′-RACE PCR反应程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸90 s，共34个循环; 72 ℃再延伸10 min。RACE PCR扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段切胶回收后与pMD19-T载体相连，转化大肠杆菌DH5α后，挑选阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将ApSeptin基因的5′-RACE、中间部分序列以及3′-RACE的cDNA序列提交DNAStar软件进行拼接，拼接成一个完整的序列，然后设计引物对拼接后的序列进行PCR验证。

1.4 ApSeptin序列分析

利用在线软件ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)寻找开放阅读框(ORF)，并将其翻译成氨基酸序列。采用SignalP3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)预测信号肽序列。利用在线BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)寻找并下载ApSeptin同源序列。蛋白质分子量和等电点预测都在Expasy (http://web.expasy.org/compute_pi/)分析。利用Clustal W2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)进行多重序列比对，由MEGA 4.1软件以邻近法(NJ法)构建系统进化树[9]。

1.5 ApSeptin基因在柞蚕不同组织的表达分析

分别取5龄第3天的柞蚕幼虫的各个组织(表皮、丝腺、脂肪体、中肠、马氏管和血细胞)，按照Trizol法提取总RNA后反转录成cDNA作为模板进行实时定量PCR，检测ApSeptin基因在柞蚕不同组织的表达情况。

将ApSeptin序列提交Primer3软件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)在线设计实时定量PCR引物qApSeptin-SP和qApSeptin-AP(表1)。同时，设计柞蚕18S内参基因的实时定量PCR引物qAp18S-SP和qAp18S-AP(表1)。分别取1 μg柞蚕各组织总RNA，加入无RNase的DNase在37 ℃处理30 min，以去除可能污染的基因组DNA。接着利用PrimeScriptTMMaster Mix进行反转录，合成第一链cDNA用于定量PCR模板。反转录程序设置为37 ℃孵育15 min, 85 ℃孵育5 s, 接着4 ℃保存备用。实时定量PCR反应体系为20 μL，包括SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，10 μm 引物各1 μL，cDNA模板1 μL(20 ng)，灭菌蒸馏水7 μL。实时定量PCR反应程序为：95 ℃变性30 s；95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 40个循环。对样品进行了10倍梯度稀释测得ApSeptin基因引物和内参基因18S引物扩增效率。实时PCR设置溶解曲线分析，以查看是否为单一的扩增产物。利用2-ΔΔCt计算[10]检测ApSeptinmRNA的相对表达量，以柞蚕18S rRNA基因mRNA的表达量做内参进行归一化处理[11]。每个样品至少重复3次，所有数据表示为mRNA相对表达量(平均值±标准差)。

表1 研究中所用到的引物

注：下划线表示酶切位点。

1.6 ApSeptin基因的原核表达

图1 柞蚕ApSeptin基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列Fig 1 cDNA and deduced amino acid sequence of ApSeptin gene in A. pernyi注：启动子ATG和终止子TAA加粗；终止信号用双划线标出。

图2 柞蚕ApSeptin的结构域分析Fig 2 Conserved domain analysis of ApSeptin

以柞蚕脂肪体cDNA为模板，设计表达引物ApSeptin-SP和ApSeptin-AP(两端分别引入BamH I和XhoI酶切位点)，见表1，采用PCR扩增ApSeptin蛋白核苷酸序列，对PCR目的产物进行切胶回收。PCR回收产物和pET28a表达载体质粒分别进行BamH I和XhoI双酶切，后利用T4 DNA ligase将酶切后的目的PCR片段与同样酶切的pET-28a载体相连接，将连接产物转化至E.coliTrans 5α感受态细胞，培养后挑取阳性克隆进行菌落PCR验证，并且对重组质粒进行序列测定，以验证插入是否正确以及是否有突变。将插入序列正确且无突变无移码的重组表达载体转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，在含50 μg/mL卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基中37 ℃震荡培养到OD600=0.6时，加入不同浓度IPTG (0.2～1 mM)诱导表达，此后培养温度调整为30 ℃，继续培养5 h后收集菌液。同时设置空表达载体(pET-28a)及不加IPTG的重组质粒菌液作为对照。菌液超声裂解后用12% SDS-PAGE检测蛋白表达情况。

2 结果与分析

2.1 ApSeptin基因克隆与序列分析

通过5′-RACE和3′-RACE PCR都获得了单一的条带，经过测序后和先前获得的部分序列拼接得到了1904 bp的ApSeptincDNA全长，该序列包含1137 bp的开放阅读框(ORF)，含160 bp 5′非编码区和607 bp 3′非编码区，其中开放阅读框编码378个氨基酸(图1)。预测该蛋白分子质量为43.31 kD，理论等电点为5.64。经SignalP 3.0在线预测发现ApSeptin没有信号肽，为非分泌型蛋白。结构域预测发现ApSeptin属于Ras-like GTPase超家族，含有5个保守的基序(G1、G2、G3、G4、G5)(图2)。系统进化树分析发现柞蚕与家蚕(Bombyxmori)、黑脉金斑蝶(Danausplexippus)聚为一类，同源性最高，其次为佛罗里达弓背蚁(Camponotusfloridanus)、切叶蚁(Acromyrmexechinatior)和行军蚁(Cerapachysbiroi)，而与果蝇(Drosophilamelanogaster)、酵母(Saccharomycescerevisiae)及人(Homosapiens)等同源性较低(图3)。通过与几个昆虫septin多重序列比对发现，柞蚕ApSeptin与黑脉金斑蝶(D.plexippus)相似性最高(94.6%)，其次是家蚕(B.mori)(93.4%)，与佛罗里达弓背蚁(C.floridanus)、切叶蚁(A.echinatior)和行军蚁(C.biroi)的相似性分别为82.7%、83.6%和83.8%(图4)。并且发现昆虫septin蛋白在N端和C端差异大，而在中间部分保守，相似性高(图4)。

图4 柞蚕ApSeptin与几种昆虫septin序列比对

图3 不同物种septin的系统发育进化树

Bombyxmoriseptin (BmSept, NP_001040346),Danausplexippusseptin (DpSept, EHJ79093),Cerapachysbiroiseptin1 (CbSept1, EZA51439),Acromyrmexechinatiorseptin1(AeSept1, EGI63223),Camponotusfloridanusseptin1(CfSeptin1, EFN67706),Drosophilamelanogasterseptin(DmPnut, gi︱730352;DmSept1, gi︱17647925;DmSept2, gi︱17738071;DmSept4, gi︱24642597;DmSept5, gi︱21356243)，Caenorhabditiselegansseptin(CeUnc59, gi︱17509405; CeUnc61, gi︱32566810),Saccharomycescerevisiaeseptin(ScCdc3, gi︱6323346; ScCdc10, gi︱6319847; ScCdc11, gi︱6322536; ScCdc12, gi︱6321899; ScShs1, gi︱6319976; ScSpr28, gi︱6320424; ScSpr3, gi︱6321496),Homosapiensseptin(HsSept1, gi︱16604248; HsSept2, gi︱4758158; HsSept3, gi︱22035572; HsSept4, gi︱4758942; HsSept5, gi︱9945439; HsSept6, gi︱22035577; HsSept7, gi︱4502695; HsSept8, gi︱41147049; HsSept9, gi︱6683817; HsSept10, gi︱8088518; HsSept11, gi︱8922712; HsSept12, gi︱23242699; HsSept13, gi︱113418512).

2.2 ApSeptin基因在柞蚕幼虫组织的表达分布

通过实时定量PCR检测柞蚕5龄第3天幼虫不同组织ApSeptin基因的表达水平，10倍梯度稀释测得ApSeptin基因引物和内参基因18S引物扩增效率分别为94.21%和93.43%，两对引物熔解曲线都只有对应的单峰，没有出现二聚体杂峰，符合定量PCR要求。定量PCR结果表明该基因在柞蚕5龄第3天幼虫的血细胞中表达量最高，其次是表皮，而在马氏管、脂肪体、中肠和丝腺中表达量相对较低(图5)。

图5 ApSeptin基因在柞蚕5龄幼虫组织的表达水平

2.3 ApSeptin的原核表达

经测序分析，重组质粒pET28a-ApSeptin构建成功，插入序列方向正确，无碱基突变，并且目的基因的阅读框与表达载体的阅读框一致。pET28a-ApSeptin转化E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示，在IPTG诱导(0.2～1.0 mM)下，在分子量为48 kD处有一条诱导表达条带，而空载体及未诱导的菌未出现目的条带，表明重组ApSeptin在大肠杆菌中表达成功，并且在0.6 mM IPTG时ApSeptin表达量最高(图6)。

图6 柞蚕ApSeptin原核表达

M—标准蛋白； 1—空表达载体； 2—未诱导对照； 3—0.2 mmol/L IPTG诱导； 4—0.4 mmol/L IPTG诱导； 5—0.6 mmol/L IPTG诱导； 6—0.8 mmol/L IPTG诱导； 7—1.0 mmol/L IPTG诱导。

3 讨论

Septin蛋白是继微管蛋白、微丝蛋白和中间纤维蛋白之后第4种细胞骨架成分，并在细胞内物质运输、细胞分裂周期调控及凋亡等生理过程中发挥了重要的作用[12]。关于septin的功能研究主要集中在人类及酵母中，而在昆虫中研究较少，且主要集中在果蝇中。果蝇中有5个septin被鉴定，被证实参与了细胞质分裂以及分裂末期卵裂沟的迁移过程，并且果蝇septin蛋白之间形成同源二聚体复合物具有结合和水解GTP的活性[3, 6]。近些年来的研究结果表明，果蝇中septin2突变的雄性是半不育的，并且septin2和septin5双突变导致果蝇蛹致死[13]。本研究所克隆的柞蚕ApSeptin与果蝇septin的同源性不高，没有聚为一类，而与家蚕及黑脉金斑蝶相似性高而聚为一类。然而家蚕及黑脉金斑蝶septin的功能还没有研究，目前还不能根据果蝇septin功能预测柞蚕ApSeptin的功能，还需要进一步对其功能进行研究。

定量PCR结果表明柞蚕ApSeptin在血细胞及表皮中表达量高，而在其他组织中相对较低。根据家蚕基因芯片结果(芯片号为sw14493)发现家蚕septin在血细胞中表达量最高，而在睾丸及卵巢中表达量也较高[14]。昆虫血细胞和表皮是主要的免疫器官，在应对外源病原物的入侵中发挥了主要作用。柞蚕ApSeptin在血细胞及表皮中表达量高暗示其可能在柞蚕先天免疫中发挥作用，但还需要进一步的研究证实。搜索家蚕EST数据库发现家蚕septin在感染BmNPV的细胞系中检测到，而在正常细胞系中没有发现，这也预测家蚕septin可能参与了家蚕的免疫。人septin 2、6、8、10和11在巨噬细胞中大量表达，并且基因敲除septin2或septin11减少吞噬体形成和免疫球蛋白包被的珠子的吸收[15]。在人类感染的发生以及病原微生物与人类相互作用的过程中，septin蛋白可能参与了人类感染过程[5]。最新研究揭示了人septin9基因在肝癌发生发展过程中的作用，抑制septin9基因的表达可有效抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,并对细胞凋亡有明显的促进作用[16]。通过肿瘤药物敏感试验选取化疗高敏感性和低敏感性大B细胞淋巴瘤组织，蛋白质组学比较研究后发现septin 9作为大B细胞淋巴瘤化疗敏感性相关标志物[17]。并且发现在44.3%的肺癌患者体内发现有septin 9启动子甲基化的现象，这对肺癌的早期诊断很有帮助[18]。

人类Septin蛋白家族与疾病的关系进行了大量研究，已证实septin家族与神经系统疾病、肿瘤、感染及男性不育症等疾病发生相关[3]。柞蚕由于具有个体大，饲养容易，生长周期短等特点，近期柞蚕基因组测序已完成，可以开发其成为研究人类生理、疾病、遗传和开发新型药物的优良模式动物。本研究克隆了柞蚕septin基因全长序列，进行了生物信息学分析，并研究了组织表达分布及原核表达，也探讨了柞蚕septin可能存在的生物学功能，为今后研究柞蚕及其他昆虫septin功能，探索以septin基因为切入点建立研究人类疾病与药物筛选的柞蚕病理学模型提供理论基础。

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