1株植物乳杆菌的抑菌作用及其生物学特性的研究

洪 伟， 薛正莲

(1. 安徽工程大学 生物与化学工程学院 微生物发酵安徽省工程技术研究中心， 芜湖 241000；2.芜湖职业技术学院 生物工程学院， 芜湖 241003)

乳酸菌是益生菌的重要内容，主要包括乳球菌、明串珠菌、片球菌、乳杆菌和肉食杆菌等[1]。植物乳杆菌是乳酸菌中的一种，常存在于发酵的蔬菜和果汁中，多数是从植物中分离得到，故命名为植物乳杆菌[2]。植物乳杆菌在食品生物技术领域具有重要的作用，目前，应用于很多发酵食品的生产中，如奶酪、干制发酵香肠、酸面团面包等[3-4]。乳酸菌作为一种益生菌，不仅具有提高食品的营养价值，改善食品风味，延长食品保存时间的功能，而且对人体有多方面的保健作用[5-8]。

植物乳杆菌通过与病原菌对限制性营养素能力竞争，来抑制病原菌的生长，调节肠道微生态组成，形成生物学屏障[9-11]。很多植物乳杆菌的抑菌谱已经报道，如杨瑾用植物乳杆菌产生的细菌素对l6个指示菌进行抑菌测定，发现该细菌素对革兰氏阳性、阴性致病菌均有较好的抑菌效果[12]。

除了细菌素共有的易被酶分解、无抗药性等特性外，迄今报道过的大部分植物乳杆菌细菌素均具有很好的热稳定性，在食品加工过程中可避免加热灭菌所引起的失活。单春乔等在121℃处理20 min 后，以大肠埃希菌为指示菌作抑菌试验，发现嗜酸乳杆菌细菌素的抑菌活性达到80%以上，并且随温度升高，其抑菌活性变化不大，表明嗜酸乳杆菌的细菌素对温度具有较好的稳定性[13]。范小兵等的研究表明，抑菌活性受pH值的影响较大，pH 值对细菌素抑菌活性的影响表现为大部分嗜酸乳杆菌细菌素的耐酸性强，在pH值较低的情况下抑菌效果明显[14]。

植物乳杆菌大都分离自发酵类食品中，具有可食用植物源性，充分保证了其所产生的细菌素在食品中应用的安全性。中国植物乳杆菌资源丰富，这有利于该菌种资源和有益代谢产物的开发。因此，植物乳杆菌有着非常广阔的开发应用前景。当前，对植物乳杆菌的抑菌作用报道甚少，更是鲜见关于该菌对温度的稳定性，pH值的耐受性及其酶的敏感性等生物学特性的报道。本文对分离自市售腌渍蔬菜的一株植物乳杆菌菌株进行抑菌性试验，并对其生物学特性进行了初步探讨，为进一步研究开发具有天然食品防腐剂前景的植物乳杆菌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

植物乳杆菌(Lactobacillusplantrum)分离自市售腌渍蔬菜，菌株编号为W5，现保存于芜湖职业技术学院生物工程系实训中心。

1.1.2 实验指示菌

9种指示菌分别为：大肠杆菌(Escherichiacoli)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonellatyphimunius)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)柠檬色葡萄球菌(Staphylococcuscitreus)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、青霉(Penicillium)及黑曲霉(Aspergillusniger)。由安徽工程大学生物与化学工程学院生物技术实验室提供。

1.1.3 试剂

蛋白酶、过氧化氢酶购自于 AMRESCO 公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶购自于BIOSHARP 公司。

培养基：MRS 培养基、LB培养基、SDAY培养基、PDA培养基。

MRS 培养基(1L)：蛋白陈 10 g、牛肉膏 10 g、酵母粉 5 g、葡萄糖 20 g、柠檬酸二铵2 g、乙酸钠 5 g、 K2HPO42 g、 MgSO4· 7H2O 0.58 g、MnSO4· 4H2O 0.25 g、Tween-80 1 mL，蒸馏水定容，置于高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌 20 min。

LB培养基(1L)：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、琼脂20 g，蒸馏水定容。分装于三角瓶内，密封。置于高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌 20 min。

SDAY培养基(1L)：蛋白胨10 g、酵母粉10 g、葡萄糖40 g、琼脂15 g。称量好上述物质，放入水中搅拌煮沸充分溶解分装至中号试管包扎，置于高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌 20 min。

PDA培养基(1L)：马铃薯200 g(去皮，切成小块煮沸20 min，纱布过虑)，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水定容。分装后置于高压蒸汽灭菌锅内121℃灭菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化培养

将冻干的植物乳杆菌接种于无菌生理盐水中，用涂板、划线法纯化菌株，把目的菌株转接到液体MRS 培养基中培养，得到液体菌种备用[15]。

1.2.2 指示菌制备[16]

大肠杆菌、藤黄微球菌、鸡白痢沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和柠檬色葡萄球菌采用LB培养基接种，于37℃恒温培养24 h左右，涂布培养法测其菌液浓度，用无菌生理盐水稀释成107个/mL菌悬液。青霉和黑曲霉则采用SDAY培养基，25℃恒温培养36 h。酿酒酵母采用PDA培养基，在28℃恒温培养36 h。指示菌均4℃冰箱保存待用。

1.2.3 发酵液的制备

将植物乳杆菌菌种以1%的接种量接入MRS 液体培养基，在37℃下厌氧培养48 h，10000 r/min 离心 10 min，收集上清液浓缩10倍后待用。

1.2.4 抑菌实验

采用稍加改进牛津杯琼脂扩散法[17]：取70 μL的各指示菌加入到8 mL的上层培养基中，振荡混匀，然后倒入预先准备好的装有10 mL底层培养基的平板上。静置放置15 min，让牛津小杯自然沉降。然后向牛津小杯中加入150 μL的待测样品。4℃冰箱扩散4 h，然后放入37℃培养箱中培养12～16 h，游标卡尺十字相交法测抑菌圈直径。

1.2.5 菌株生物学特性研究

对温度的稳定性： 将发酵液在121℃高压锅内处理20 min，对照CK不经过高温处理，分别以大肠杆菌、柠檬色葡萄球菌、藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌作为指示菌进行抑菌试验。

对pH值的耐受性：用1 mol/L的HCI和1 mol/L的NaOH调节发酵上清液pH值2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，以大肠杆菌为指示菌进行抑菌试验，以相同pH值的生理盐水作为对照。观察抑菌圈大小的变化，每处理3个重复。

对酶的敏感性[18]：分别取胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、过氧化氢酶20 mg加入到20 mL灭菌过的超纯水中，配制成1 mg/mL，均保存于-20℃，备用。将发酵上清液与酶液等体积混合，置于37℃下反应30 min。以大肠杆菌为指示菌，分别观察添加酶液前后抑菌圈大小的变化。

1.3 数据处理

试验数据应用SPSS(2001)数据处理系统进行统计分析，试验结果经方差分析后进行Duncan′s 多重比较检验各处理间的差异显著性(P=0.05)。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈直径的测量

表1 乳酸菌发酵液的抑菌谱

注：表中数据表示平均值±标准差；同列数据后不同字母表示差异显著，小写字母表示0.05水平上的差异显著水平，大写字母表示0.01水平上的差异显著水平。下表同。

从表1中数据可知，9种指示菌中，该植物乳杆菌对6种具有抑制作用。植物乳杆菌发酵液能较强的抑制大肠杆菌、柠檬色葡萄球菌、藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌等指示菌。而对酿酒酵母、青霉和黑曲霉3种真菌类指示菌不具有抑菌效果，因而，该植物乳杆菌具有广泛的抑菌谱。

2.2 对温度的稳定性

发酵上清液在121℃条件处理20 min抑菌活性有所降低，但依然保留较高活性，仍具有明显的抑菌活性，对大肠杆菌、柠檬色葡萄球菌、藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈大小分别为26.25 mm、23.28 mm、24.62 mm和20.68 mm。说明高温不会破坏代谢产物中的抑菌物质，表明该植物乳杆菌产生的抑菌物质具有热稳定性，这一性质与已报道的嗜酸乳杆菌细菌素的热稳定性相似[13](表2)。

表2 不同温度下的抑菌圈直径

2.3 对pH值的耐受性

经试验，对照1 mol/L的HCI对指示菌并没有抑制作用，由此可知，发挥抑菌作用的是该植物乳杆菌。由图1 结果表明，在pH值在2～8之间抑菌作用均很稳定，在pH值为6时，抑菌活性最强，但随着pH值增大，抑菌作用有不断下降的趋势。

图 1 pH值对植物乳杆菌的抑菌作用的影响

注：柱形图上端的字母表示各pH值抑菌差异程度，相同字母差异不显著，不同字母差异显著(邓肯式新复极差检测,P< 0.05)。

2.4 对酶的敏感性

由表3结果可得，该植物乳杆菌对蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶均敏感，处理后的抑菌直径分别为3.36 mm、2.42 mm和2.34 mm，几乎被完全降解。但对过氧化氢酶的敏感性则较低，用过氧化氢酶处理和未做处理的上清液的抑菌圈大小基本一致，排除过氧化氢所起的抑菌作用的干扰，发酵上清液中存在其它具有抑菌作用的物质。

表3 不同酶处理前后抑菌圈直径的大小

3 讨论

随着经济与社会的不断发展及人们生活水平的不断提高，人们对绿色食品、健康食品有了新的认识和要求[19]。当前对乳酸杆菌类抑菌物质的研究不断深入，与本文所得类细菌素粗品性质类似抑菌物质也有相关报道，但多对于革兰氏阳性菌有抑菌活性[20]。本试验结果表明，该植物乳杆菌的抑菌物质对大肠杆菌、柠檬色葡萄球菌、藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌等指示菌都有明显的抑菌作用，因此抑菌物质有较广的抑菌谱，能对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有抑制作用。这一结果为细菌素在食品防腐剂工业和医药领域的应用提供了保障和依据。

生化特性研究主要包括对温度的稳定性、对pH值的耐受性及对酶的敏感性。结果表明，该植物乳杆菌具有良好的热稳定性，即使在121℃下处理20 min仍具有较好的抑菌活性；同时植物乳杆菌在pH值2～12条件下，都具有抑菌活性，其中在pH值为6时抑菌活性最强，说明该菌株具有较广的酸碱抑菌谱；此外，该细菌素对蛋白酶K、胰蛋白酶以及胃蛋白酶均敏感，但对过氧化氢酶不敏感。这些良好的生化特性为植物乳杆菌的进一步的应用奠定基础。

下一步将在选育抑菌活性强和生物学性状优良的植物乳杆菌菌株的基础上，对该菌的最佳发酵条件进行研究；面对该菌发酵液中活性成分、代谢途径、作用机制将是今后的研究重点。只有这样才能更加深入地开发与应用植物乳杆菌。

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