蛋白质磷酸化对肉品质影响的研究进展

陈立娟，李 欣，张德权，何 凡，陈 丽，沈清武

（中国农业科学院农产品加工研究所，农业部农产品加工综合性重点实验室，北京100193）

1 蛋白质磷酸化反应的概念

蛋白质磷酸化反应是20世纪50年代Fischer、K rebs等在研究糖原新陈代谢调控时发现的一种动态调控机制。1992年，Fisher和Krebs因其在蛋白质可逆磷酸化方面的研究获得了诺贝尔生理学及医学奖。自此，作为最广泛的蛋白质翻译后修饰方式，蛋白质磷酸化反应受到了广泛的关注。蛋白质磷酸化反应是指由蛋白激酶催化的将ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程。该反应主要发生于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等残基侧链的羟基上，在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰[3-4]。鉴于蛋白质磷酸化反应在生命活动中的重要意义，研究蛋白质磷酸化反应过程的机理及其对生物功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白质组学家非常重视的问题。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteom ics）这一新概念[5]。磷酸化蛋白质组学从整体水平上研究磷酸化蛋白质在细胞中的组成成分、表达水平、修饰状态及相互作用规律。在磷酸化蛋白质组学受到关注的同时，各种磷酸化蛋白质的分析技术也应运而生。

2 磷酸化蛋白质的分析技术

对磷酸化蛋白质进行研究，首先要建立磷酸化蛋白质检测方法，由于磷酸化蛋白质含量非常低，需对磷酸化蛋白质进行富集，同时，蛋白质磷酸化反应是一个动态过程，在很多研究中需对磷酸化蛋白质进行位点分析和定量。鉴于以上需求，磷酸化蛋白质检测方法的研究主要集中在磷酸化蛋白质的富集、位点分析和定量分析方法上。

2.1 磷酸化蛋白质（肽）的富集

常见的磷酸化蛋白质（肽）的富集方法包括免疫共沉淀法、强阴阳离子交换色谱、MALDI靶板富集法及固定金属离子亲和色谱等。其中免疫共沉淀法主要利用可以特异性识别磷酸化丝氨酸、磷酸化酪氨酸、磷酸化苏氨酸的抗体与已经发生磷酸化的多肽进行免疫共沉淀，然后利用离心分离的方法纯化磷酸化多肽，但是由于磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸的抗原决定簇都比较小，与抗体的结合能力较弱，所以通常只用该方法纯化酪氨酸磷酸化多肽[6]。强阴阳离子交换色谱法富集磷酸化肽对样品的需样量较大，而且要对分离出的每一种物质进行分析，因而工作量较大。MALDI靶板富集法可实现样品的直接在线富集和检测，但是该方法目前只能对相对简单的蛋白质样品进行分析，对于复杂生物样品的富集效果目前仍不理想。固定金属离子亲和色谱法对单磷酸化肽和多磷酸化肽都具有较好的富集能力，与其他方法相比更适合复杂生物样品中磷酸化肽的富集，但富含酸性氨基酸的非磷酸化肽也能与金属离子结合造成非特异性吸附，从而对磷酸化肽的富集造成干扰。以上方法各有优势但仍不能实现对低丰度磷酸化蛋白质（肽）进行大规模高通量的分析，为进一步增强富集效果，减少非特异性吸附，多重富集材料或富集方法的联用将成为未来磷酸化蛋白质（肽）富集的重要方向[7]。

2.2 生物质谱分析磷酸化位点

利用一级质谱结合串联质谱可确定磷酸化位点，如通过MALDI-TOF/TOF一级质谱可发现与肽段分子量理论值相差80u（HPO3=80u）的质谱峰，该峰的二级质谱图中若母离子与旁边的最高强度的质谱峰相差98u（中性丢失H3PO4=98u），则可确定该肽段为磷酸化肽段，进一步通过二级或多级质谱的谱图确认具体的磷酸化位点。此外，利用β-消除反应使苏氨酸、丝氨酸磷酸化残基转化为氨乙基丙氨酸（赖氨酸的同形物），此位点可被胰蛋白酶和肽链内切酶等酶特异性识别、酶切，通过质谱即可很容易地判断磷酸化位点。所以磷酸化位点的确认有赖于简化的串联质谱和质谱谱图的应用以及质谱检测灵敏度的提高[8]。近年来生物质谱技术的发展为蛋白质磷酸化位点的检测提供了更多可选择的仪器和方法，如轨道离子阱质谱（Orbitrap MS）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR MS）等[9]。

2.3 磷酸化蛋白质定量分析

常用的磷酸化蛋白质定量分析方法包括双向差示凝胶电泳、荧光染料Pro-Q Diamond dye染色和稳定同位素标记法。双向差示凝胶电泳是在双向电泳的基础上发展起来的灵敏且能进行定量分析的新方法，它采用荧光试剂标记蛋白质并通过荧光成像获取电泳图像，能够比较精确地在较宽的动态范围内对研究者感兴趣的蛋白质进行定量，特别对包括有多组别和多个生物学重复情况的研究具有其独特的优势。荧光染料染色（Pro-Q Diamond）是Molecular Probes公司前几年推出的一种磷酸化蛋白质荧光染料，它可以直接对聚丙烯酰胺凝胶中的磷酸化蛋白质进行选择性染色，无需同位素或特异性抗体，只要通过荧光扫描仪检测就可以直接显示出一维或二维凝胶电泳胶上分离的磷酸化蛋白质，对非磷酸化蛋白质的反应性很低，荧光强度会随着蛋白质磷酸化程度的不同而呈现出一定的变化。2000年，Weckwerth、W illmitzer和Fiehn等首次提出稳定同位素标记（stable-isotope labeling，SIL）与液质联用进行蛋白质定量，开辟了定量蛋白质组学的一个新技术平台，与传统的定量方法（如双向电泳）相比，稳定同位素标记技术在定量准确度和规模化定量分析方面都有很大的应用前景[10]。

3 蛋白质磷酸化反应与肉品质的关系

由于蛋白质磷酸化反应对生物体内众多过程都有影响，蛋白质磷酸化反应在越来越多的领域引起关注，目前对于蛋白质磷酸化反应的研究主要集中在医学、物理化学、生物化学等领域，其中医学方面的研究主要集中在蛋白质非正常磷酸化与疾病的关系[11-12]以及通过调控激酶水平来达到治疗疾病的目的[13]；物理化学方面的研究主要集中在优化磷酸化蛋白质（多肽）的富集方法上[14]；生物化学方面的研究主要集中在蛋白质磷酸化反应对酶活的影响以及蛋白质磷酸化反应与信号传导的关系[15-16]。

从蛋白质磷酸化反应被发现至今已经有70多年，但此前的研究主要集中在以上提到的医学、物理化学、生物化学等方面，蛋白质磷酸化反应对肉品质的研究却较少。蛋白质磷酸化反应在医学、生物化学等方面的研究使人们意识到蛋白质磷酸化反应对生物体内众多过程的重要影响，进而引发人们对于宰后肌肉成熟过程中蛋白质磷酸化反应的关注。前期对磷酸化蛋白质研究方法的探索为蛋白质磷酸化反应在肌肉样品中的研究奠定了方法基础，而医学和生物化学方面以肌肉为原料对蛋白质磷酸化反应的研究也为肉品的相关研究提供了理论基础。近几年关于蛋白质磷酸化反应对肌肉影响的研究主要集中在宰后胴体蛋白质磷酸化反应与糖酵解、肌肉收缩和蛋白质降解的关系三个方面。

3.1 蛋白质磷酸化反应与糖酵解的关系

糖酵解作为宰后肌肉最主要的供能方式，与肌肉的颜色、pH、系水力以及肌肉僵直都有直接关系。

畜禽养殖环境对畜禽的健康生长具有重要影响。以往养殖场主要以粗放形式来进行，很多畜禽养殖场综合规划与布局并不合理，很多饲料喂养在一定程度上缺乏合理性。畜禽养殖棚昼夜温差大这种问题在一定程度上对畜禽的健康生长将会产生很大影响。

Huang等以猪背最长肌为原料研究蛋白质磷酸化水平与pH下降速率和宰后时间的关系发现，部分蛋白质的磷酸化水平受pH和宰后时间的综合影响，其中有7种与糖代谢有关的酶磷酸化模式受宰后pH下降速率和宰后时间的综合影响。他指出不管在体内还是体外大部分糖酵解酶可以被不同的激酶催化发生蛋白质磷酸化反应，之后糖酵解酶的活性或者稳定性会增强。而糖酵解反应是影响宰后pH下降的主要因素，由此Huang等推测蛋白质磷酸化反应通过对糖酵解酶活性的调控进而影响肉的品质[17-18]。

除Huang以外，Doum it[19]、Reiss[20]、Sale等[21]都认为猪背最长肌中的糖酵解酶如丙酮酸激酶、磷酸果糖激酶的活性受自身磷酸化程度的影响，这两种酶发生磷酸化反应后会变得更加活跃，因此他们认为蛋白质磷酸化反应可提高肌肉糖酵解反应，他们还认为蛋白质磷酸化反应可通过提高肌肉糖酵解反应、降低宰后蛋白水解反应而对肉色、保水性、嫩度产生不利影响[19]。

蛋白质磷酸化反应与糖酵解反应密不可分，但目前在不同的实验材料中对于不同种类的酶得出的结论并不一致。Angelo等认为牛背最长肌中部分糖酵解酶的活性与它们的蛋白质磷酸化水平成反比，糖酵解酶如二磷酸果糖酶、烯醇酶发生磷酸化反应后活性会降低[15，22]。

综上所述，蛋白质磷酸化反应会通过对糖酵解酶活性的调控影响宰后肌肉糖酵解反应，进而影响肉品质。

3.2 蛋白质磷酸化反应与肌肉收缩的关系

很多学者发现包括肌动蛋白、原肌球蛋白、肌球蛋白轻链、肌间线蛋白、肌钙蛋白在内的多种肌原纤维蛋白都会发生磷酸化反应[23-25]。

Gang等通过敲除肌球蛋白轻链激酶基因发现肌球蛋白轻链发生磷酸化反应会提高平滑肌收缩的速度和强度，由此指出肌球蛋白轻链磷酸化是快肌收缩增强的初级生化机制[26]。James等通过改变钙离子浓度控制肌球蛋白轻链激酶活性，发现肌球蛋白轻链发生磷酸化会引起肌球蛋白结构改变，并且发现由此会增加肌球蛋白产生收缩力的强度[27]。Joan Gannon通过研究嫩度有显著差异的3月龄和30月龄小鼠肌肉中蛋白质磷酸化水平的变化和发生变化的蛋白质种类发现，随着年龄增长蛋白质磷酸化水平发生变化最大的是肌球蛋白轻链2、肌动蛋白、原肌球蛋白和肌间线蛋白。鉴于以上几种蛋白在肌肉收缩中的重要性，Joan Gannon认为年龄可通过蛋白质磷酸化水平的改变而影响肌肉收缩[28]。Huang等也得出了相似的研究结论，鉴定出的磷酸化蛋白质中很多蛋白质都与肌节功能有关。在磷酸化程度最高的条带中肌钙蛋白T，原肌球蛋白和肌球蛋白轻链2被鉴定出来。实验表明宰后肌肉中以上肌原纤维蛋白的磷酸化模式主要受宰后时间影响，其次受pH下降速率影响。鉴于肌原纤维蛋白在肌肉收缩中的重要作用，Huang推测肌原纤维蛋白磷酸化反应可能与肌肉僵直和肌肉品质变化有关[17]。

Perry，Bailey等在研究中发现磷酸化酶b激酶、AMP依赖性蛋白激酶、GMP依赖性蛋白激酶、Ca2+依赖性磷脂敏感蛋白激酶可以使骨骼肌和心肌中肌钙蛋白I发生磷酸化反应[29-30]，Moir，Pinna等在研究中则发现磷酸化酶b激酶、肌钙蛋白T激酶、酪蛋白激酶TS、Ca2+依赖性磷脂敏感蛋白激酶可以使肌钙蛋白T发生磷酸化反应。肌钙蛋白作为肌肉的主要调节蛋白，直接参与钙离子控制的肌肉收缩[31-32]。Moir，Perry等在研究中发现肌钙蛋白发生磷酸化对肌肉收缩的速度和强度有重要影响[29，31]，但是肌钙蛋白磷酸化对肌肉收缩的影响机制目前并不清楚。

综合以上学者的观点可知：包括肌球蛋白轻链、肌钙蛋白、原肌球蛋白、肌动蛋白在内的多种肌原纤维蛋白都会发生蛋白质磷酸化反应，但是除肌球蛋白轻链以外的肌原纤维蛋白通过蛋白质磷酸化反应对肌肉收缩的具体影响结果以及影响机理有待进一步研究。

3.3 蛋白质磷酸化反应与蛋白质降解的关系

宰后肌纤维蛋白的降解，特别是结构蛋白和细胞骨架蛋白的降解，可导致肌纤维结构完整性被破坏和肉的嫩化，促进肉的成熟[33]。大量研究表明钙蛋白酶是引起宰后成熟过程中肌纤维蛋白降解和肉嫩化的主要蛋白酶，钙蛋白酶通过对肌纤维蛋白的降解引起肌肉超微结构的破坏，尤其是Z线的破坏和消失，使得肌原纤维小片化和肉的嫩化[34-35]。

Fabio和Toyo等认为蛋白激酶可以使肌钙蛋白T和肌钙蛋白I发生蛋白质磷酸化反应，肌钙蛋白T和肌钙蛋白I由AMP依赖性蛋白激酶催化发生蛋白质磷酸化反应后会降低对钙蛋白酶降解信号的灵敏度，从而可以降低钙蛋白酶对它们的降解[36-37]。Doum it等指出钙蛋白酶抑制蛋白会发生蛋白质磷酸化反应，而钙蛋白酶抑制蛋白发生蛋白质磷酸化反应后会增强对钙蛋白酶的抑制作用，从而减少钙蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解[19]。由以上学者的观点可知，肌钙蛋白发生磷酸化反应可以降低钙蛋白酶对它的降解而钙蛋白酶抑制蛋白发生磷酸化反应可以降低钙蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解。

Angelo等认为蛋白质磷酸化不仅能调节糖酵解酶的活动，还能增强结构蛋白的稳定性，由此他们推测牛肉中的蛋白质磷酸化反应是由肌肉转变为可食用肉的重要影响因素，翻译后修饰可能对肉的嫩度框架复杂性有深远影响[15]。王思丹等也认为作为细胞骨架的主要组成部分之一的肌动蛋白发生磷酸化可能会改变肌细胞的结构，例如肌纤维结构的降解等，进而影响宰后肌肉的僵直进程[38]。

如前所述，蛋白质磷酸化反应会对肌肉的糖酵解反应产生影响，而糖酵解反应是影响宰后pH下降速率的主要因素，对于肌肉宰后成熟过程而言，pH的变化是引起诸如蛋白酶活性等改变的重要因素[39]，pH通过引起蛋白酶活性的改变影响宰后肌肉中蛋白质的降解，也就是说蛋白质磷酸化会通过多种中间途径对蛋白质降解产生间接影响。

综上所述，蛋白质磷酸化反应对肌肉内部的众多生理生化反应都有重要影响，目前的研究认为蛋白质磷酸化反应会通过对糖酵解酶活性的影响调控宰后肌肉糖酵解反应，通过对肌球蛋白轻链的影响促进肌肉收缩，通过对肌钙蛋白、钙蛋白酶抑制蛋白、结构蛋白等的影响降低蛋白降解。肌肉收缩和蛋白降解是影响宰后肌肉品质变化的两个重要因素，对肌肉的尸僵进程和嫩化过程有重要影响。由此我们可以认为，蛋白质磷酸化反应是由肌肉转变为可食用肉过程中的重要影响因素。

4 展望

近年来，随着分子生物学、生物化学、生物信息学、计算机等技术的快速发展，作为蛋白质组学的重要组成部分的磷酸化蛋白质组学已经在磷酸化肽及磷酸化蛋白的鉴定、磷酸化位点分析及其定量分析方面取得了很大的成就，然而，在研究中新问题不断涌现，研究者们面临着重大的挑战。由于蛋白质磷酸化是一个动态过程，在细胞中磷酸化蛋白含量低，磷酸化位点可变，磷酸肽的质谱信号常常会受到抑制，目前还没有一种方法或技术路线可以解决磷酸化蛋白质组学中遇到的所有问题，所以磷酸化蛋白质组学研究需要更加特异有效的分离方法，高灵敏度的鉴定方法以及快速、高效、准确的质谱检测方法，从而实现从少量生物样品中解析全部磷酸化蛋白质的目标。

对于蛋白质磷酸化反应与肉品质的关系虽有部分研究已取得结论，但是具体机制仍不明确。并且目前国内针对蛋白质磷酸化与肉品质关系的研究较少，还需要大量的研究工作，当前的主要任务是在先进的磷酸化蛋白质组学技术的基础上探究蛋白质磷酸化反应影响嫩度、保水性、色泽等品质的机理，以便为改善肉品质提供理论依据。

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