桦木醇吡啶盐衍生物的合成及其生理活性研究

栾俊颖， 池万福， 韩荣弼

( 延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室， 吉林 延吉 133002 )

桦木醇及其衍生物具有抗HIV[1-3]、抗肿瘤[4-6]和消炎[7-8]等作用，而且在抗HIV、抗肿瘤等方面显示出靶向作用强、不良反应小的特性.2005年S.C.Agnieszka等人[9]发现白桦脂醇对酒精引起的肝细胞损伤具有明显的保护作用；Tang J J等人[10]研究发现桦木醇能够降低通常被固醇调节元件结合蛋白(SREBP)“打开”的基因活动，指出其有可能成为高脂血症药物开发的先导化合物.H.Kommera等人[11]研究发现在桦木酸的C-3的羟基上连接氯乙酰基时，其在体外的抗癌活性比桦木酸大大增加.本文以桦木醇1为原料，将其与溴乙酰氯发生酯化反应得到化合物2，然后将化合物2与吡啶反应得到化合物3，最终再通过阴离子交换得到目标化合物4a-c(合成路线见图1)，并对各化合物的活性进行了探讨.

图1 桦木醇吡啶盐衍生物的合成

1 合成

1.1 仪器和试剂

1H-NMR用AV-300型超导核磁共振波谱仪(德国Bruker公司，TMS为内标)测定；熔点用X-5型显微熔点仪(温度计未经校正)测定；红外光谱用IRPrestige-21型傅立叶变换红外光谱仪测定.所有反应试剂均为市售分析纯，购买后未经处理直接使用.

1.2 桦木醇(1)的提取

桦木醇的提取和纯化按文献[12-13]方法进行，所得桦木醇的熔点、红外以及氢谱数据与文献值一致.

1.3 溴乙酰氯的制备

在溴乙酸(13.8 g，100 mmol)中，加入二氯化亚砜(10 mL)， 85 ℃下搅拌2 h，蒸馏收集120 ℃的馏分，得到9.1 g黄色液体.产率为64%, b.p.127～128 ℃;1H-NMR(CDCl3,300 MHz) δ: 4.35(s,2H,H—CH2),13C-NMR(75 MHz,CDCl3) δ: 165.74, 33.63.

1.4 28-O-溴乙酰基桦木醇(2)的制备

将桦木醇1 (0.44 g，1.0 mmol)和三乙胺(0.28 mL，2.0 mmol)溶解于二氯甲烷(8 mL)中，在冰浴中边搅拌边滴加含有82 μL溴乙酰氯(1 mmol)和4 mL二氯甲烷的混合溶液，继续反应6 h；水洗(10 mL×3)，干燥，减压除去溶剂得白色固体0.341 g，产率为56%.1H-NMR(CDCl3,300 MHz) δ: 4.52, 4.62(each s,1H,H-29), 3.88,4.30(each d,1H,J=9.6 Hz,H-28), 3.76～3.82(m,2H,OCOCH2Br), 3.05～3.18(m,1H,H-3), 2.28～2.45(m,1H,H-19), 1.61(s,1H,H-30), 0.95, 0.90, 0.89, 0.75, 0.68(each s,3H,5×CH3).

1.5 28-O-(2-吡啶乙酰基)桦木醇溴化盐(3)的制备

1.6 28-O-(吡啶乙酰基)桦木醇盐(4a-c)的制备

将化合物3 (0.22 g，0.35 mmol)和硝酸银或醋酸银、硫酸银(0.70 mmol)溶解于乙醇(10 mL)中，用频率为600 Hz的超声波超声震荡1 h.抽滤，用大量乙醇冲洗，减压除尽溶剂后分别得黄色固体(4a) 0.384 g、灰白色固体(4b) 0.384 g和棕色固体(4c) 0.384 g.

2 体外细胞活性测试

测试细胞为肝星状细胞(HSC cell)、人肺癌细胞(A549 cell)和人肝癌细胞(HepG 2 cell).

细胞存活率测定采用MTT法：①将上述单细胞悬液分别接种于96孔细胞培养板(1×104cells/well)中. ② 在37 ℃及一定的湿度条件下培养24 h后，将培养液换成5%血清；加药，使化合物3、4a-c的终浓度为100 μg/mL和200 μg/mL，每个浓度设3个平行空，同时设阴性对照(仅含培养液)，继续培养48 h.③在培养结束前4 h掺入20 μL MTT (5 mg/mL)，培养结束后离心(4 ℃，2 000 r/min，5 min)，吸去上清液后，每个孔加入100 μL DMSO，并用微量振荡器震荡，使紫色晶体完全溶解；用酶标仪在540 nm波长条件下测定光吸收OD值. ④计算细胞增殖抑制率(抑制率=(1-OD样品/OD空白对照)×100%，然后根据不同待测物及其不同浓度的实验数据，将抑制率与药物浓度做图，得出剂量反应曲线，计算出半数抑制浓度(IC50)值.

桦木醇吡啶盐衍生物对肝星状细胞(HSC cell)、人肺癌细胞(A549 cell)和人肝癌细胞(HepG 2 cell)的生长存活率见图2—图4 (图中数据为每组平行3次实验数据的平均值).由图2—图4可见，除化合物4b外，化合物3、4a和4c均对上述3种细胞有明显的抑制作用.由图5可以看出，化合物3、4a和4c对人肝癌细胞(HepG 2 cell)的IC50值分别为19.43，18.95,24.83 μg/mL，均明显小于桦木醇的IC50值(44.19 μg/mL)[14].这说明化合物3、4a和4c对人肝癌细胞(HepG 2 cell)的抑制作用强于桦木醇.

图2 4种化合物对肝星状细胞的活性测试结果

图3 4种化合物对人肺癌细胞的活性测试结果

图4 4种化合物对人肝癌细胞的活性测试结果

图5 桦木醇与化合物3、4a、4c的IC50值对比

3 结论

本文以桦木醇为原料合成了4种桦木醇吡啶盐化合物，并用IR和1H-NMR对这4种化合物进行了表征.采用MTT比色法测试了这4种化合物对肝星状细胞、人肝癌细胞、人肺癌细胞的细胞活性，结果表明，化合物3、4a、4c对上述3种细胞有着较好的抑制作用.这3种化合物对其他癌细胞的活性价值还有待于进一步研究.

参考文献：

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