延边地区长柱金丝桃中4种酮类成分的含量测定

姜英子， 王科斯， 金慧颖， 安仁波,3*

( 1.延边大学药学院， 吉林 延吉 133002； 2.延边第二人民医院， 吉林 延吉 133001;3.延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室， 吉林 延吉 133002 )

0 引言

中草药随产地的不同其化学成分的含量也有不同，同时制药企业应用不同的制药工艺，也会导致同种中草药产生不同的疗效；因此，研究中草药中的生物活性成分和测定标志性成分的含量具有非常重要的意义.

长柱金丝桃(HypericumascyronL.)为藤黄科(Guttiferae)金丝桃属植物，广泛分布于我国东北、内蒙古和黄河、长江流域以及朝鲜、日本、俄罗斯(西伯利亚)等地.研究[1-2]表明，长柱金丝桃味苦、性寒，具有平肝、凉血、止血、败毒、消肿、泻火解毒等功效，民间常用于外伤止血、去除黄疸、治疗肝炎及疮疖肿毒等症.文献[3]研究表明：长柱金丝桃中所含金丝桃苷具有镇静解痉、抗炎、止咳等作用，虽能够减少肺通气量但并不抑制呼吸中枢节律活动；槲皮素可治支气管炎、解痉降压；山奈酚可抗菌、抗炎、止咳祛痰.文献[4-12]显示，长柱金丝桃还含有二蒽酮类衍生物、黄酮类化合物、五环三萜类化合物、口山酮类和间苯三酚衍生物及甾醇混合物和甾醇苷类化合物.本文利用高效液相色谱(HPLC)法对延边地区长柱金丝桃中的芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚进行了含量测定，为合理开发利用长柱金丝桃资源和长柱金丝桃质量标准的研究提供参考.

1 仪器和材料

仪器有L-2400型高效液相色谱仪(含L-2400型紫外检测器)(日本Hitach公司)，FA2004型万分之一电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)，SK1200H型超声波清洗脱气器(上海科岛超声仪器有限公司)，RRH-100型万能高速粉碎机(香港欧凯莱芙实业公司)，Diamonsil C18色谱柱(北京迪马科技有限公司).芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚购买于上海融禾医药科技发展有限公司，甲醇和乙腈均为色谱纯，超纯水和其他试剂均为分析纯.长柱金丝桃于2011年5—8月间采自延边朝鲜族自治州内10个县市，由延边大学药学院吕慧子副教授鉴定为藤黄科金丝桃属植物长柱金丝桃的全草，凭证标本存放于延边大学药学院.

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1供试样品溶液 精密称取长柱金丝桃粉末0.5 g(过40目筛)置于圆底烧瓶中，加入甲醇50 mL后超声提取40 min；提取液置50 mL容量瓶中定容，用0.45m微孔滤膜过滤后作为供试品试样.

2.1.2对照品溶液 分别精密称取芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚对照品，置50 mL容量瓶中后加甲醇稀释至刻度，摇匀，定容.制成浓度分别为6.0，30.0,12.0，18.0g/mL的溶液，经0.45m微孔滤膜滤过，备用.

2.2 色谱条件[13-15]

色谱柱为Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5m),流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，检测波长为360 nm，进样量为20L，流动相为甲醇-乙腈-0.6%磷酸水溶液.梯度洗脱条件见表1.

表1 色谱分离中流动相的洗脱条件

对照品及供试样品色谱图见图1，按保留时间，出峰顺序分别为芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚.

1.芦丁； 2.金丝桃苷； 3.槲皮素； 4.山奈酚图1 对照品(A)和供试品(B)溶液的HPLC色谱图

2.3 线性

混合对照品溶液，稀释制备成系列浓度的混合标准品溶液，以峰面积值为纵坐标(Y)，浓度(μg/mL)为横坐标(X)，通过绘制标准曲线求出4种成分的线性回归方程及线性范围(见表2).

表2 4种酮类成分的回归方程及线性范围

2.4 精密度

将对照品溶液按2.2的色谱条件重复进样6次，分别测定芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的峰面积，结果显示RSD值分别为1.79%、1.63%、1.85%、1.71%，这表明精密度良好.

2.5 重复性

将同一份供试样品溶液按选定的色谱条件注入色谱仪，分别测定芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的含量，结果显示RSD值分别为1.43%、1.66%、1.97%、1.78%(n=5)，这表明本方法具有良好的重复性.

2.6 稳定性

在不同时间(0,2,4,8,12,24 h)分别测定供试样品溶液中芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的峰面积，结果显示RSD值分别为1.80%、1.77%、0.91%、1.93%(n=6)，说明供试样品溶液在24 h内稳定.

2.7 加标回收率

在已知含量的延边地区长柱金丝桃药材(芦丁0.149 mg/g、金丝桃苷1.054 mg/g、槲皮素0.449 mg/g、山奈酚0.487 mg/g)中分别定量加入芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚，按2.1.1制备成供试样品溶液，并按2.2的色谱条件分别测定芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的含量，其回收率和RSD值见表3.

2.8 不同区域样品的含量测定

将延边地区不同区域的长柱金丝桃样品按2.1.1制备成供试样品溶液，在2.2的色谱条件下进样20L，并同时测定芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的含量，结果见表4.

表3 加标回收率试验结果(n=9)

表4 延边地区长柱金丝桃中4种酮类成分的含量 mg/g

注：—表示在此条件下提取，不能满足本含量测定要求.

3 讨论

芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山奈酚在360 nm与270 nm波长处有较强吸收，但在360 nm波长处杂质峰较少，故选定360 nm为检测波长.本色谱条件可满足同时测定长柱金丝桃中4种酮类成分含量的HPLC分析方法要求.

根据文献[14-15]选择不同的流动相进行了试验，结果显示：以甲醇-水为流动相时，洗脱能力和分离度均较差；以甲醇-0.6%磷酸水溶液为流动相时，峰型较好，但分离度差；以甲醇-乙腈-0.6%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱时，芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚4种成分都能得到很好的分离，并且峰形较好，所以本文选用了甲醇-乙腈-0.6%磷酸水溶液为流动相进行了梯度洗脱.我们还考查了不同流速(0.8,1.0 mL/min)的甲醇-乙腈-0.6%磷酸水溶液对分离结果的影响，结果表明当流速为1.0 mL/min时其效果最佳.

本文测定结果表明，延边各地区的长柱金丝桃中芦丁的平均含量在0.089～0.265 mg/g，金丝桃苷的平均含量在0.489～1.418 mg/g，槲皮素的平均含量在0.179～0.450 mg/g，山奈酚的平均含量在0.169～1.968 mg/g.这表明区域不同，芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚的含量也不同，而且具有显著性差异.

本文研究表明，利用HPLC对长柱金丝桃药材中的4种酮类(芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚)成分的含量同时进行测定，方法灵敏、可靠、快捷，可为今后长柱金丝桃质量标准的研究提供参考.

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