凝血因子Ⅻ缺陷症导致再发体外受精和胚胎移植失败原因2例分析

谢海啸，王莹宇，周武，王秀秀，王明山

（温州医科大学附属第一医院 检验科，浙江 温州 325015）

·临床经验·

凝血因子Ⅻ缺陷症导致再发体外受精和胚胎移植失败原因2例分析

谢海啸，王莹宇，周武，王秀秀，王明山

（温州医科大学附属第一医院 检验科，浙江 温州 325015）

目的：探讨机体凝血因子Ⅻ（FⅫ）水平对再发体外受精和胚胎移植（IVF-ET）的影响。方法：检测患者凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血因子Ⅻ促凝活性（FⅫ:C）、纤溶酶原活性（PLG:C）、D-二聚体（D-D）等凝血指标；PCR扩增FⅫ基因的14个外显子及其侧翼序列，进行DNA测序，发现基因突变，则反向测序予以证实。50例正常对照组用于排除FⅫ基因多态性。结果：2例FⅫ缺陷患者APTT显著延长，FⅫ:C明显降低。患者1基因分析发现g.6753delACA杂合突变（国内外鲜见报道）和46T/T。患者2发现g.7142insertC杂合突变和46C/T。结论：FⅫ缺陷症患者易导致机体纤溶功能下降，是引起患者IVF-ET失败的重要原因之一。

凝血因子Ⅻ；体外受精-胚胎移植；基因；缺陷

凝血因子X I I（FX I I）是内源性凝血途径的启动因子；同时在纤溶系统中，FX I I由于具有与组织型纤溶酶原激活物（t-PA）和尿激酶型纤溶酶原激活物（u-PA）同源性的丝氨酸结构，也参与纤溶途径的激活，纤溶酶原的内激活途径主要由活化的FX I I（FX I Ia）来完成。FX I I缺乏易导致纤溶功能下降，是静脉血栓栓塞症（VTE）的危险因素[1]。已有学者报道部分再发流产可能因为形成胎盘微血栓而导致，与FX I I缺陷有关[2]。体外受精和胚胎移植（IVF-ET）俗称“试管婴儿”技术，开始于1978年，是一种辅助生育技术，该技术至今已相对成熟。IVF-ET失败容易发生在妊娠早期，再发IVF-ET失败与再发流产有很多相似之处。本研究收集了2例FX I I缺陷患者，对其再发IVF-ET失败的原因进行了探讨。

1 资料和方法

1.1 一般资料患者1：女，25岁，双侧输卵管堵塞，2次IVF-ET失败。2次均在胚胎植入第14天查血清绒毛膜促性腺激素（hCG）低下，分别在胚胎植入第16天和第22天流产。患者血浆凝血酶原时间（PT）正常；活化部分凝血活酶时间（APTT）显著延长；凝血因子X I I促凝活性（FX I I:C）极度降低。患者肝肾功能正常，无自身免疫性疾病，无长期服药史。

患者2：女，34岁，重度子宫内膜异位症，2次IVF-ET失败。第一次在胚胎植入第30天B超发现宫外孕，流产。第二次在胚胎植入第14天流产。2次均表现为hCG低下。患者PT正常，APTT明显延长，FX I I:C明显下降。患者肝肾功能正常，无自身免疫性疾病，无长期服药史。

正常对照组50例，其中男23例，女27例，年龄18～59岁，平均30岁，均为我院健康体检者。对照组经查均无肝肾功能疾病，无血栓或出血史，采样前已征得本人同意。正常对照组用于排除FX I I基因多态性。

1.2 方法

1.2.1 标本采集和处理：在征得患者知情同意后，采集外周静脉血，0.109 mol/L枸橼酸钠1:9抗凝，立即于3 000 r/min离心10 min后收集上层血浆用于凝血指标检测，2 h内检测完毕。剩余的血细胞-40 ℃冻存，用于DNA提取。

表1 2例FXII缺陷患者凝血指标项目检测结果

1.2.2 凝血相关指标检测：法国STAGO全自动血凝仪检测PT、APTT、纤维蛋白原（FIB）、凝血因子VI I I促凝活性（FVI I I:C）、凝血因子I X促凝活性（FI X: C）、凝血因子X I促凝活性（FX I:C）和FX I I:C、狼疮抗凝物（LAC）、纤溶酶原活性（PLG:C）、D-二聚体（D-D）。试剂由STAGO公司配套提供。所有操作步骤均严格按照试剂说明书进行。

FX I I基因测序：按常规酚-氯仿法抽提患者外周血基因组DNA。根据FXI I基因序列（GenBank AF538691），应用primer5软件共设计7对引物以覆盖FXI I基因的所有外显子区域及其侧翼序列[3]。引物由上海桑尼生物工程有限公司合成。PCR产物原液送上海桑尼生物工程有限公司测序。用Chromas软件将测序结果与美国NCBI基因库所公布的FX I I基因序列进行比对，寻找基因突变。发现基因突变的序列则反向测序予以证实。

2 结果

2.1 凝血指标检测2位患者APTT均明显延长，FX I I:C都明显下降。其余凝血指标PT、FIB、FVI I I: C、FIX:C、FXI:C、LAC基本正常，PLG:C偏高，D-D较低。见表1。

2.2 FX I I基因分析患者1：FX I I exon1启动子区46位多态性为46T/T型（见图1a），exon9区克隆测序，4条克隆序列有2条发现6753-6755位缺失了3个碱基ACA，另2条序列正常，即发生了g.6753delACA杂合突变（见图1b）。通过对50例正常对照组进行筛查及查询基因多态性数据库（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/snp），初步排除了基因多态性的可能，且查询FX I I基因突变数据库未发现该位点（http:/ /www.hgmd.cf.ac.uk/ac/all.php），故认为g. 6753delACA突变为新的突变。患者2：FX I Iexon1启动子区46位多态性为46C/T型（见图1c），exon10区7142位插入一个碱基C，即g.7142insertC杂合突变（见图1d），该位点已有报道[4]。

3 讨论

人类FX I I基因定位于染色体5q33-qter，DNA全长约为12 kb，含14个外显子和13个内含子。FX I I是在肝脏中合成的丝氨酸蛋白酶，是一个由596个氨基酸残基组成的单链糖蛋白。成熟FX I I含有数个结构功能区：自氨基末端起分别是I I型纤维连接蛋白区（type I I）-表皮生长因子同源（EGF）区-I型纤维连接蛋白区（type I）-EGF区-kringle区和催化区，且FXI I启动子区对雌激素敏感。FXI I的蛋白结构与t-PA和u-PA相似，FX I I由激肽-激肽释放酶活化为FX I Ia，FX I Ia参与纤溶系统内激活途径，使纤溶酶原转化为纤溶酶。遗传性FX I I缺陷症在高加索人群中发病率为1.5%～3.0%[5]。目前较多学者认为FX I I缺陷是静脉血栓和心肌梗死的危险因子。FX I I缺陷没有明显的临床症状，大多是体检或术前常规检查发现APTT延长，若是中等程度的FX I I缺陷，APTT可能还在正常范围内，这更加不能引起临床重视，存在FX I I缺陷的漏检。

图1 2例患者FXII基因测序图

再发流产是指2次及2次以上自然流产，引起再发流产有很多原因，包括染色体异常、内分泌异常、自身免疫病及其他病症等，但可能还有其他潜在的原因未能引起重视，例如母体内凝血和纤溶系统是否失衡等。有文献[6]报道FX I I活性低下人群有12%再发流产，而正常对照组为1.5%。再发流产可能与FX I I活性减低有关[2，7-8]。再发IVF-ET失败患者与再发流产有很多相似之处，日本学者Matsubayashi等[9]研究了110名再发IVF-ET失败患者的FX I I活性，发现其平均活性明显低于正常对照组，并建议有必要对IVF-ET成功组和IVF-ET失败组的FX I I活性进行比对，希望能明确FX I I活性低于多少会增加IVF-ET失败的风险。本课题组已对遗传性凝血因子缺陷症进行了数年的研究[3，10]，现收集到2例再发IVF-ET失败且APTT明显延长的FX I I缺陷症患者，对其FX I I表型和基因水平进行了检测。

患者1 FXI I基因检测发现exon1启动子区46T/ T和exon9编码区g.6753-6755delACA突变。患者2发现exon1启动子区46C/T和exon10编码区g.7142insertC。FX I I基因exon1启动子区第46位多态性较常见，分别有46C/C、46C/T、46T/T三种基因型，46C/C为野生型。C→T置换后，在原始起始密码子ATG前4个碱基处形成一个新的起始密码子，从这个突变的起始密码子开始下游第7个碱基处产生终止密码子（TGA），从而使翻译提前终止，导致FX I I活性下降。46T/T基因型比46C/T基因型更能引起FX I I活性降低[1]。患者1另一突变为exon9区g.6753delACA。本课题组曾报道过exon9区g.6800del9bp突变[3]，该突变蛋白在COS7细胞内大量积聚，但伴有分泌障碍，导致细胞外蛋白表达下降。本资料中g.6753delACA距g.6800del9bp较近，推测该突变有可能也会导致FX I I蛋白表达下降，且g.6753delACA突变致使第271位密码子天冬酰胺缺失，该密码子距离exon9区剪切位点仅有2个氨基酸位置，它的缺失很可能不利于exon9区的结构稳定，其具体机制有待进一步研究。患者2另一突变是exon10区g.7142insertC，致使346位氨基酸赖氨酸变成谷氨酰胺（Lys346Gln），并在编码了68个氨基酸后产生终止密码子，即产生了截短蛋白[4]。本研究推测患者1 FX I I:C极度降低，可能由启动子区46T/T和exon9编码区g.6753delACA突变共同引起；患者2的低FX I I:C可能由启动子区46C/ T和exon10编码区7142insertC导致。

FX I I的缺陷会使纤溶功能降低，因为纤溶酶原的内激活途径主要由FX I Ia来完成。2例FX I I缺陷患者均有纤溶功能低下的表现：PLG偏高，D-D较低。PLG是血浆纤维蛋白水解酶无活性的前体，当血液凝固时，PLG大量吸附在纤维蛋白网上，在纤溶酶原激活剂作用下，转化为纤溶酶，促使纤维蛋白溶解。PLG增高表示纤溶活性减低，如高凝状态、血栓性疾病等。D-D是交联纤维蛋白降解的特异标志物之一，D-D含量下降提示纤溶功能受抑制。2例FX I I缺陷患者实行IVF-ET后，因本身FX I I活性低下，纤溶功能降低，有血栓形成倾向，有可能会在母体胎盘绒毛间隙形成微血栓[2]等，有较大的流产危险。

综上所述，本研究对2例再发IVF-ET失败患者进行了FX I I基因检测，发现了exon9区新的g.6753delACA杂合突变，及exon10区g.7142insertC杂合突变和较常见的46C/T多态性。2例患者再发IVF-ET失败和FX I I水平严重缺陷有关。FX I I缺陷易导致机体纤溶功能下降，是引起患者IVF-ET失败的重要原因之一，建议临床有必要对再发IVF-ET失败患者进行FX I I水平检测，有助于IVF-ET的风险评估。

[1]Tirado I, Soria JM, Mateo J, et al. Association after linkage analysis indicates that homozygosity for the 46C→T polymorphism in the F12 gene is a genetic risk factor for venous thrombosis[J]. Thromb Haemost, 2004, 91(5): 899-904.

[2]Pauer HU, Burfeind P, Köstering H, et al.Factor XII deficiency is strongly associated with primary recurrent abortions[J]. Fertil Steril, 2003, 80(3): 590-594.

[3]谢海啸, 吕美艳, 杨小丽, 等. 一种导致遗传性凝血因子XII缺陷症的FXII基因新突变[J]. 中华医学遗传学杂志, 2013, 30 (3): 313-317.

[4]王学锋, 戴菁, 王明山, 等. 两个遗传性凝血因子XII缺陷症家系FXII基因突变分析[J]. 诊断学理论与实践, 2005, 4(6): 447-450.

[5]Halbmayer WM, Haushofer A, Schön R, et al. The prevalence of moderate and severe FXII (Hageman factor) deficiency among the normal population:evaluation of the incidence of FXII deficiency among 300 healthy blood donors [J]. Thromb Haemost, 1994, 71(1): 68-72.

[6]Iinuma Y, Sugiura-Ogasawara M, Makino A, et al. Coagulation factor XII activity, but not an associated common genetic polymorphism (46C/T), is linked to recurrent miscarriage[J]. Fertil Steril, 2002, 77(2): 353-356.

[7]Yamada H, Kato EH, Ebina Y, et al. Factor XII deficiency in women with recurrent miscarriage[J]. Gynecol Obstet Invest, 2000, 49(2): 80-83.

[8]Ogasawara MS, Aoki K, Katnano K, et al. Factor XII but not protein C, protein S, antithrombin III, or factor XIII is a predictor of recurrent miscarriage[J]. Fertil Steril, 2001, 75: 916-919.

[9]Matsubayashi H, Sugi T, Suzuki T, et al. Decreased Factor XII Activity is associated with recurrent IVF-ET failure[J]. Am J Reprod Immunol, 2008, 59(4): 316-322.

[10]徐鹏飞, 王明山, 谢海啸, 等. 低纤维蛋白原血症患者中发现一种新的γ链Asp316His突变[J]. 温州医学院学报, 2011, 41(4): 346-348.

（本文编辑：吴健敏）

Factor XII deficiency in two women with recurrent in vitro fertilization-embryo transfer failure

XIE Haixiao, WANG Yingyu, ZHOU Wu, WANG Xiuxiu, WANG Mingshan.Department of Laboratory, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To identify the possible correlation of FXII deficiency with recurrent IVF-ET failure.Methods:Prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), FXII procoagulant activity (FXII:C), Plasminogen activity, D-Dimer and other coagulant parameters were detected. Exons 1-14, boundary introns including the splice junctions of the FXII gene were amplified with Polymerase chain reaction (PCR). The PCR products were purified and sequenced directly. If a gene mutation was found, then reverse sequence to confirm it. Fifty heathy persons as normal controls.Results:Both APTT in the two patients were significantly prolonged. And the FXII:C values of the patients were low. Patient 1 was found heterozygous deletion mutation g.6753delACA in exon 9 and 46T/T genetype in the promoter region of FXII gene. Patient 2 was found heterozygous insert mutation g.7142 insertC in exon 10 and 46C/T genetype. The mutation of FXII g.6753delACA was a new mutation. Conclusion: FXII deficiency may contribute to impairment of fibrinolytic activity. Decreased FXII activity may be one of the important reasons of recurrent IVF-ET failure.

coagulation factor XII; in vitro fertilization-embryo transfer; gene; deficiency

R394

B

1000-2138（2014）04-0286-04

2013-08-19

温州市科技计划资助项目（Y20100 208)。

谢海啸（1979-），女，浙江温州人，主管技师。

王明山，副主任技师，硕士生导师，Email：wywms@ 126.com。