昆明小鼠强迫游泳实验与悬尾实验抑郁模型相关性

孙世光，刘 健，鹿 岩，孙 鹏，魏 盛，乔明琦，张惠云

（山东中医药大学1．药学院，3．中医药经典理论教育部重点实验室，山东济南 250355；2．第二附属医院药学部脑行为分析实验室，山东济南 250001）

昆明小鼠强迫游泳实验与悬尾实验抑郁模型相关性

孙世光1，2，刘 健2，鹿 岩2，孙 鹏3，魏 盛3，乔明琦3，张惠云3

（山东中医药大学1．药学院，3．中医药经典理论教育部重点实验室，山东济南 250355；2．第二附属医院药学部脑行为分析实验室，山东济南 250001）

目的探讨强迫游泳实验（FST）和悬尾实验（TST）作为昆明小鼠抑郁动物模型的相关性。方法成年雄性昆明小鼠先后进行TST和FST，摄像系统分别记录6 m in内的行为变化，实验间隔1周，实验参数有不动状态潜伏期和不动状态持续时间百分率；采用因子分析、聚类分析、相关分析、一致性检验和生存分析等多种统计方法进行数据处理。结果①因子分析提示，FST与TST参数分别反映了FST与TST 2种不同抑郁模型维度。②聚类分析提示，不动状态潜伏期参数反映了抗抑郁状态，不动状态持续时间百分率反映了抑郁样绝望行为；经过适当数据转换后，FST与TST参数分别反映了FST与TST 2种不同抑郁模型维度。③相关分析结果提示，FST与TST参数组内具有较好相关性，而组间不动状态潜伏期参数相关性尚可。④一致性检验ICC统计参数提示，FST与TST参数评价抑郁样绝望行为一致性均较差；Kappa统计参数提示，不动状态潜伏期可作为FST与TST评价抑郁样绝望行为一致性的稳定参数。⑤生存分析提示，FST与TST的不动状态潜伏期参数半数生存期差异有统计学意义，即FST与TST实验操作对实验动物首次产生抑郁样绝望行为的效力不同，且FST＜TST。结论FST与TST参数反映了2种不同抑郁模型维度；不动状态潜伏期是FST与TST评价抑郁样绝望行为一致性及首次产生抑郁样绝望行为效力的稳定参数；FST与TST联合进行抗抑郁药物评价时，应注意动物模型异质性问题。

抑郁症；动物模型；强迫游泳实验；悬尾实验；相关性

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．01．016

强迫游泳实验（forced swimming test，FST）与悬尾实验（tail suspension test，TST）是抗抑郁药物评价模型的经典方法，广泛应用于精神神经药理学的基础研究［1－4］。FST是通过无法逃脱水环境而诱导产生抑郁绝望行为，属于“湿型”行为绝望模型；TST是通过无法克服不正常体位而诱导产生抑郁绝望行为，属于“干型”行为绝望模型；FST和TST两者具有相同的设计原理，即利用动物无法逃逸恶环境而导致绝望行为［5－8］。TST通常采用不动状态潜伏期和不动状态持续时间百分率来评价动物的不动状态，而FST除了采用上述参数评价不动状态之外，还可通过评价游泳、攀爬、潜水及抖头等动作来综合评价FST抑郁样绝望行为［9］。尽管多种抗抑郁药物均可逆转FST和TST实验动物不动状态，但也存在例外：FST对于选择性5-羟色胺再摄取抑制剂不敏感［10］，TST对于γ-氨基丁酸B受体拮抗剂不敏感［11］。既然如此，FST与TST作为抗抑郁药物评价动物模型是否具有相关性和一致性，依据目前文献这些都是未知。因此，本研究选取FST和TST两者共有评价参数：不动状态潜伏期和不动状态持续时间百分率，采用因子分析、聚类分析、相关分析、一致性检验及生存分析多种统计方法，以初步探讨FST和TST作为抑郁模型的相关性。抗抑郁药物初筛时通常主要选取不动状态持续时间百分率参数，不动状态潜伏期参数常因非正态分布等统计因素而未被充分利用；本研究采取生存分析来处理不动状态潜伏期也是一次尝试，后续研究也证实不动状态潜伏期作为行为绝望模型的稳定参数，可提高抗抑郁药物活性筛选的效力［4］。

1 材料与方法

1．1 实验动物

昆明小鼠，雄性，由山东中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（鲁）20050015。室温18～22℃，光照12 h（6：00～18：00）和黑暗12 h（18：00～6：00）环境，自由进水饮食饲养；预适应环境1周后，选取20只体质量18～22 g小鼠进入正式实验（所有实验均于19：00～24：00进行）。

1．2 实验装置

FST与TST实验装置均由本实验室自行制作；包括悬尾箱（20 cm×20 cm×30 cm），侧立，周壁及底面均为黑色；烧杯，恒温水浴锅，秒表，计数器，奥尼ANC酷睿HD1080P高清摄像头。

1．3 不动状态潜伏期和不动状态持续时间百分率的测定

先进行TST实验，间隔1周再进行FST实验。实验环境由25 W红色白炽灯提供照明；采用Mini-VCap 5．6．3正式版监控软件进行录像，全部实验结束后由不熟悉实验设计人员进行数据提取。不动状态潜伏期和不动状态持续时间百分率（后4 m in内不动状态持续时间／240 s×100%）。

FST：操作者将小鼠放入装有温水的圆形烧杯，直径10 cm，水深10 cm，水温23～25℃，用摄像系统记录动物6 m in内不动状态潜伏期及后4 m in内不动状态持续时间。不动状态是指动物放弃主动挣扎，躯体处于漂浮不扭动状态。

TST：操作者用不粘胶将小鼠尾尖部1／3处悬于悬尾箱内，使其头部正对镜头离箱底约10 cm，用摄像系统记录动物6 m in内不动状态潜伏期及后4 m in内不动状态持续时间。不动状态是指动物放弃主动挣扎，躯体处于悬垂不扭动状态。

1．4 因子分析法分析模型维度

本实验不动状态潜伏期和不动状态持续时间百分率参数经Factor Ana lysis程序完成因子分析，以Principal components提取公因子，以累计贡献率＞80%作为因子纳入标准，采用Varim ax正交旋转。

1．5 聚类分析法分析模型维度

本实验不动状态潜伏期和不动状态持续时间百分率参数经Hierarchical C luster Analysis程序完成聚类分析，采用R型变量聚类，选择Betweengroups linkage测量方法和Pearson Correlation距离类型。

1．6 相关分析法分析FST与TST相关性

本实验不动状态潜伏期和不动状态持续时间百分率参数经Bivariate Correlation程序完成相关分析，所有数据先进行Kolmogorov-Smirnov正态分布检验。Pearson相关系数适用于连续变量，Spearman相关系数适用于分类变量或变量值分布不明或明显非正态分布。

1．7 一致性检验分析FST与TST一致性

本实验不动状态潜伏期和不动状态持续时间百分率参数可通过级间校正系数（ICC）和Kappa参数来评价FST与TST一致性；ICC参数主要适用于连续变量或等级变量，由Reliability Analysis程序完成；Kappa参数主要适用于分类变量，由Crosstabs程序完成，分析前首先根据分位数进行低、中、高抑郁绝望状态分类；当参数ICC，Kappa＞0．75认为一致性很好，0．50～0．75为一致性一般，＜0．50则为一致性很差。

1．8 生存分析分析不动状态潜伏期参数

本实验不动状态潜伏期经Kaplan-Meier p lot程序完成生存分析，半数生存期采用Log rank test统计分析。

2 结果

2．1 强迫游泳实验与悬尾实验结构维度分析

2．1．1 因子分析

KMO和Bartlett球形检验提示，FST和TST参数变量并不独立，相关性尚可，适合进行因子分析（KMO＝0．404，χ2＝29．050，P＜0．01）。因子分析提示（表1，图1），FST参数主要对抑郁因子Ⅰ（FST因子，45．02%）贡献大；TST参数主要对抑郁因子Ⅱ（TST因子，38．33%）贡献大；而不动状态潜伏期和不动状态持续时间百分率对其抑郁因子载荷呈负相关。

Tab．1 Principal components and varimax rotation of forced swimming test（FST）and tail suspension test（TST）parameters

Fig．1 Behavioral pattern of parameters from FST and TST after principal component analysis．

2．1．2 聚类分析

FST-TST原始参数可分2类（图2A）：FST-不动状态潜伏期与TST-不动状态潜伏期为第1类，反映了抗抑郁状态；FST-不动状态持续时间百分率与TST-不动状态持续时间百分率为第2类，反映了抑郁样绝望状态。不动状态潜伏期与不动状态持续时间百分率呈负相关，通过适当数据转换后（转换后不动状态潜伏期＝总记录时间－不动状态潜伏期）FST-TST变换参数可分为2类（图2B）：FST-转换后不动状态潜伏期与FST-不动状态持续时间百分率为第1类，反映了FST抑郁样绝望行为；TST-转换后不动状态潜伏期与TST-不动状态持续时间百分率为第2类，反映了TST抑郁样绝望行为。

Fig．2 Parameters of FST and TST by cluster analysis．A：original parameters；B：parameters after latency transformation．

2．2 强迫游泳实验与悬尾实验相关性

Kolmogorov-Smirnov正态分布检验提示，所有参数和因子均符合正态分布，故采用Pearson相关分析。相关分析提示（表2），FST和TST参数组内均具有较好负相关（Pearson＝－0．759，P＜0．01；Pearson＝－0．541，P＜0．05）；FST不动状态潜伏期与TST不动状态潜伏期组间具有较好正相关（Pearson＝0．489，P＜0．05）。

2．3 强迫游泳实验与悬尾实验一致性

ICC参数提示，FST与TST各参数评价抑郁样绝望行为一致性较差；Kappa参数提示，不动状态潜伏期可以作为FST与TST的稳定参数，评价两者

Tab．2 Correlation matrix of parameters from FST and TST

抑郁样绝望行为一致性较好（Kappa＝0．680，P＜0．01）（表3～表5）。

Tab．3 Categorization of depression on parameter″latency″from FST and TST

Tab．4 Categorization of depression on parameter″immobility″from FST and TST

Tab．5 lntraclass correlation coefficient（lCC）and Kappa agreement coefficient be tween depression levels on FST and TST

2．4 强迫游泳实验与悬尾实验不动状态潜伏期参数差异性

Kaplan-Meier plot提示（图3），FST半数生存期为55 s，即50%动物从FST水环境寻找出路到首次出现抑郁样绝望行为所需时间为55 s；TST半数生存期为35．5 s，即50%动物从TST悬挂挣扎逃逸到首次出现抑郁样绝望行为所需时间为35．5 s；Log rank test提示两者差异有统计学意义（χ2＝5．785，P＜0．05），提示FST与TST实验操作对实验动物首次产生抑郁样绝望行为的效力不同：FST借助水环境寻找出路无望产生抑郁样绝望行为，TST借助悬挂逃逸无望产生抑郁样绝望行为，且两者效力比较：FST＜TST。

Fig．3 Kaplan-Meier plot for parameter″latency″from FST and TST．

3 讨论

本研究因子分析结果提示，FST与TST参数分别反映了FST与TST两个不同抑郁维度。聚类分析提示不动状态潜伏期反映了实验动物抗抑郁样绝望状态，不动状态持续时间百分率反映了实验动物抑郁样绝望状态；经适当数据转换后，聚类分析结果与因子分析结果保持一致：FST与TST参数分别反映了FST与TST两个不同抑郁维度。相关分析提示，FST与TST参数组内均具有较好相关性，组间仅不动状态潜伏期参数相关性尚可；ICC统计参数提示，FST与TST参数评价一致性均较差；而Kappa统计参数提示，不动状态潜伏期可以作为FST与TST评价实验动物抑郁样绝望行为一致性的稳定参数。生存分析提示，不动状态潜伏期参数的半数生存期差异有统计学意义，反映了FST与TST实验操作对实验动物首次产生抑郁样绝望行为的效力不同，且FST＜TST。综上所述：①FST与TST参数反映了实验动物不同的抑郁状态维度；②FST与TST具有不同的结构维度，提示两者产生抑郁样绝望行为的生物学机制不同；③FST与TST评价实验动物抑郁样绝望行为一致性及首次产生抑郁样绝望行为效力时，不动状态潜伏期参数是一个可以考虑的稳定参数；④FST与TST联合进行抗抑郁药物评价时，要注意动物模型异质性。

FST和TST设计简单，操作迅速，具有较好预测效度：多种抗抑郁药物均可逆转其不动状态，具有共同的设计原理：利用动物无法逃逸恶劣环境而产生绝望行为，常联合以“行为组学”形式，用于抗抑郁药物的快速初筛。尽管如此，FST和TST作为行为绝望模型仍然存在较大争议［12－14］：① 动物出现的不动状态是因疲劳所致还是因公认的绝望所致；②实验操作和动物影响结果一致性；③药物靶点敏感性及量效曲线规律性。De Pab lo等［15］认为，FST的不动状态更多的是一种学习获得性不动。Sunal等［16］研究证实，FST实验烧杯直径、水深度及观察时间不同，实验结果亦不同；Alonso等［17］研究证实不同性别动物FST实验结果一致性不同；David等［18］和Ripoll等［19］研究发现，不同种属小鼠评价不同抗抑郁药物时，FST与TST抗抑郁反应不同；Bourin等［20］进一步提出“抗抑郁决策树”：通过4种不同种属小鼠（远交系：Sw iss，NMRI；近交系：C57Bl／6J，DBA／2）结合FST与TST不同药效反应，来评价不同抗抑郁药物作用机制。Renard等［21］研究证实，FST可明显改变Swiss小鼠大脑内单胺类神经递质的浓度（5-羟色胺、多巴胺及其代谢产物二羟苯乙酸），而TST则无明显影响；Lucki等［10］、Mombereau等［11］和Bai等［22］等研究发现，FST与TST对不同种类抗抑郁药物的质反应与同一药物的量反应均不同：FST对选择性5-羟色胺重吸收抑制剂不敏感，而TST对γ-氨基丁酸B受体拮抗剂不敏感；经典抗抑郁药物丙米嗪在FST呈U型量效曲线，而在TST呈线性量效曲线。

动物模型是研究疾病发生机制和评价药物效应的有力工具；动物模型行为具有多维性，是结构和功能共同相互作用的结果。因此，基于基因与环境共同作用将是动物模型未来发展方向。

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Correlation between forced swimming test and tail suspension test in Kunming mice

SUN Shi-guang1，2，LIU Jian2，LU Yan2，SUN Peng3，WEI Sheng3，QIAO Ming-qi3，ZHANG Hui-yun3
（1．College of Pharmacy，3．Key Laboratory of the Classical Theory of Traditional Chinese Medicine of Ministry of Education，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China；2．Behavioral Brain Analysis Laboratory，Department of Pharmacy，the Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250001，China）

OBJECTlVETo explore the correlation between forced sw imm ing test（FST）and tail suspension test（TST）as animal models of depression in Kunming mice．METHODSThe behavior of adult male Kunming m ice in TST and FST was recorded by sequence for six minutes and at a one-week inter-trial interval．The following parameters were evaluated：the latency to the first bout of immobility（latency）and the percentage of duration of immobility during the last4 m in of the 6-min trial（immobility／%）．Subsequently，factor analysis，c luster analysis，correlation analysis，consistency check and survival analysis were calculated for these parameters．RESULTS①Factor analysis revealed that the variance of FST and TST contributed respectively to FST-depression factor and TST-depression factor．②The two groups were shaped by cluster analysis，whatever the original or transformed data．③Correlation analysis displayed a good intercorrelation between variances of either FST or TST，and a good intracorrelation for the parameter Latency between FST and TST．④Only Kappa reflected a fair consistency on evaluation of FST and TST when the parameter″latency″was considered．⑤Significant difference between FST-and TST-median survival of the parameter″latency″was found，suggesting that the later had more effect on decurtating the latency to the first bout of immobility．CONCLUSlONFST and TST variances account for two different factors，and the parameter″latency″is worth considering for evaluation of consistency and effectiveness between FST and TST．Attention should be paid to heterogeneity of animal models when FST is combined with TST as a″behavionomics″．

depression；animal model；forced swimming test；tail suspension test；correlation

SUN Shi-guang，E-mail：S．G．SUN＠hotmail．com，Tel：（0531）82436123

R965．2

A

1000-3002（2014）01-0107-06

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81302887）；Science and Technology Development Program of Traditional Chinese Medicine of Shandong Province（2011-107）；and Science and Technology Development Program of Traditional Chinese Medicine of Shandong Province（2013-103）

2013-06-03 接受日期：2013-10-12）

（本文编辑：乔 虹）

国家自然科学基金项目（81302887）；山东省中医药科技发展计划项目（2011-107）；山东省中医药科技发展计划项目（2013-103）

孙世光（1983－），男，2013级博士研究生，主要从事方剂配伍规律与证候动物模型研究。

孙世光，E-mail：S．G．SUN＠hotmail．com，Tel：（0531）82436123