克咳片对老年大鼠慢性阻塞性肺疾病的治疗作用

邝少松，严家荣，钟志勇，黄小琼，刘盛来，唐小江

（1．广东省医学实验动物中心比较医学实验室，广东佛山 528248；2．华南农业大学兽医学院，广东广州 510180）

克咳片对老年大鼠慢性阻塞性肺疾病的治疗作用

邝少松1，2，严家荣1，钟志勇1，黄小琼1，刘盛来1，唐小江1

（1．广东省医学实验动物中心比较医学实验室，广东佛山 528248；2．华南农业大学兽医学院，广东广州 510180）

目的观察克咳片对慢性阻塞性肺疾病（COPD）的治疗作用。方法14～16月龄SD大鼠采用烟熏联合气管内3次滴注脂多糖法制备COPD模型，从造模开始至第31天，模型成功率53%。50只模型大鼠随机分为模型对照、通宣理肺片600 mg·kg－1和克咳片180，360和720 mg·kg－1组，每组10只，继续每天给予烟熏2次，每次60 m in，每次间隔30 m in，连续30 d。同时，各治疗组ig给予相应药物治疗30 d。末次给药后第2天，用ELISA方法检测血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白三烯C4（LTC4）含量，用RC Invasive气道阻力和肺顺应性检测系统检测肺功能的吸气时间（Ti）、呼气时间（Te）、呼气峰值（PEF）、肺顺应性（Cydn）和气道阻力（RI），用HE染色观察肺组织病理变化。结果与正常对照组相比，模型对照组TNF-α和LTC4含量均增加（P＜0．05），PEF值降低（P＜0．05），RI值延长（P＜0．05），Ti，Te和Cydn值无明显变化，肺组织肺炎细胞浸润，肺气肿病变显著，表明模型制备成功。与模型对照组相比，通宣理肺片600 m g·kg－1能降低LTC4含量（P＜0．05），延长Cydn值（P＜0．05），降低RI值（P＜0．05）；克咳片180，360和720 mg·kg－1均可降低RI值（P＜0．05），克咳片360和720 mg·kg－1可降低LTC4含量（P＜0．05），克咳片720 mg·kg－1还可延长PEF值（P＜0．05），减少肺组织炎症细胞浸润（P＜0．05）。结论克咳片对大鼠COPD具有一定的改善作用。

克咳片；慢性阻塞性肺疾病；模型，动物

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．01．005

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是目前世界上导致人类死亡的第四位主要原因，是我国农村首位、城市第四位的人口死亡原因，其主要疾病机制是肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应。COPD是一种以不完全可逆的气流受限为特征的疾病，气流受限呈不完全可逆、进行性发展，多与肺部对有害颗粒和气体的异常炎症反应相关［1］。反复发作是治疗COPD的一大难点，中药治疗COPD具有长期有效和副作用小的优势。克咳片是由麻黄、罂粟壳和甘草等组成的中药复方，在止咳、定喘和祛痰方面具有良好的功效［2－4］，但其对COPD的治疗效果及作用机制尚无研究报道。吸烟和反复不断的气道感染被认为是引起COPD发病的最主要危险因素［5］，它们可以直接损害并诱导气道炎症，引起肺泡内的巨噬细胞和上皮细胞释放一系列炎症介质，激活和吸引中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞向肺部迁徙，从而加剧炎症反应，导致氧化-抗氧化系统和蛋白酶-抗蛋白酶系统失衡，驱动COPD发病过程［6］。长期慢性炎症刺激导致气道壁损伤和修复过程反复循环发生，平滑肌细胞增殖，胶原含量增加，瘢痕组织形成，最终导致气道重构，管壁增厚，管腔狭窄甚至闭塞［7］。因此，本研究选用老年SD大鼠，采用气道内滴入脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）和被动吸烟的方法建立COPD大鼠模型，以更接近于COPD发生发展的病理生理机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物

SPF级SD大鼠14～16月龄，104只，雄性41只，体质量600～900 g；雌性63只，体质量300～500 g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SCXK（粤）2008-0002。饲养于广东省医学实验动物中心SPF级动物实验室，实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2008-0002。

1．2 药物、试剂和仪器

克咳片，由中山市中智药业集团有限公司提供，国药准字Z20050690，批号：20100512，主要成分麻黄、罂粟壳、甘草、苦杏仁、桔梗、莱菔子和石膏，辅料为蔗糖、硬脂酸镁和欧巴代，执行标准是国家食品药品监督管理总局标准YBZ25192005。实验时用蒸馏水分别配制成18，36和72 g·L－1的药液，现用现配。通宣理肺片，购自广东省博罗先锋药业集团有限公司，国药准字Z20027037，批号：005002，用时用蒸馏水配制成60 g·L－1的药液，现用现配。

LPS，购自美国Sigma公司；阿托品，购自天津药业集团新郑股份有限公司；肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白三烯C4（leukotriene，LTC4）含量测定试剂盒，均购自武汉华美生物工程有限公司。

RC Invasive气道阻力和肺顺应性检测系统，美国BUXCO公司；BX41病理图像分析系统，日本奥林巴斯公司；TS-12N生物组织全自动脱水机、BM-Ⅶ生物组织包埋机及冷冻机和RS-18生物组织全自动染色机，均为湖北孝感医用仪器有限公司。

1．3 慢性阻塞性肺疾病模型的制备和分组

造模方法参考文献［8］并加以改动，增加LPS滴注次数及延长烟熏时间。大鼠适应性饲养1周，雌雄按性别完全随机分为正常对照组10只和模型组94只。将模型组大鼠置于一密闭的180 cm× 160 cm×50 cm的烟室中，每次100 g烟叶，60 m in，每天2次，每次间隔30 m in，连续30 d。正常对照组大鼠不进行烟熏造模。模型组大鼠于造模第1，10和21天，按照0．5 mg·kg－1sc给予阿托品，30 m in后ip给予3%戊巴比妥钠进行麻醉，在气管插管注射0．1%LPS 200μl，然后将大鼠固定板直立旋转，使LPS液均匀分布于两肺，正常对照组给予等量生理盐水。烟熏第31天将存活的模型动物随机分为模型对照、通宣理肺片600 mg·kg－1和克咳片180，360和720 mg·kg－1组，每组10只，继续烟熏30 d，同时按照10 m l·kg－1每天ig给予相应的药物。模型对照组和正常对照组给予等量的蒸馏水。

1．4 大鼠一般情况的观察

实验期间，每天观察大鼠精神、反应、活动和毛发等，并观察有无大鼠死亡。

1．5 大鼠肺组织病理变化检测

麻醉处死大鼠，取肺组织用4%甲醛溶液固定3 d，常规脱水，透明，石蜡包埋，切片（厚度4μm），HE染色，封片后光镜下观察组织病理变化。用BX41型O lympus正置显微镜加Image-Pro Express显微图像分析系统对病理切片摄片，按照表1进行肺损伤分级评价。

Tab．1 Patho logical g rad ing standards of lung in ju ries

Continued

1．6 大鼠肺功能检测

末次给药后第2天将大鼠运至广州市呼吸研究所，采用RC Invasive气道阻力和肺顺应性检测系统测定大鼠吸气时间（inspiratory time，Ti）、呼气时间（expiratory time，Te）、呼气峰值（peak expiratory flow，PEF）、肺顺应性（dynamic lung compliance，Cydn）和气道阻力（airway resistance，RI）的变化。

1．7 血清肿瘤坏死因子α和白三烯含量测定

连续给药30 d后，乙醚麻醉大鼠，经眼底静脉丛采血，室温静置30 m in后，864×g离心10 m in，取上清。根据试剂盒说明书进行TNF-α和LTC4的含量检测。

1．8 统计学分析

2 结果

2．1 大鼠一般症状

模型组和各给药组大鼠毛发均失去光泽，黄涩，神情较倦怠，体型较消瘦，正常对照组未出现以上症状。由于大鼠体质及疾病加重等原因，大鼠死亡44只，造模成功率为53%。在给药过程中，各组均有1～3只大鼠死亡。

2．2 克咳片对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织病理变化的影响

Fig．1 Effect of Keke tab lets on pathological changes in lung tissue of aged rats with chronic obstructive pulmonary diseases（COPD）（HE×40）．The COPD rat model was established using the combination of smoking with endotracheal lipopolysaccharides．On the 31st day after the preparation of the model，the rats were ig given Tongxuanlifei tablet or Keke tablet．The rats of each group continued to smoke twice a day，60 m in each time，at an interval of30 m in，for another 30 d．A：normal control；B：model；C：Tongxuanlifei tablet600 mg·kg－1；D－F：Keke tablet180，360 and 720 m g·kg－1group，respectively．The red arrow show inflammatory cell infiltration；and the green arrow show alveolar interval fracture merging into pulmonary bullae．

由图1结果显示，正常对照组大鼠镜下可见各级支气管结构完整，黏膜上皮细胞排列整齐，未见变性、坏死、脱落，纤毛未见粘连及脱落，管壁及平滑肌厚度正常，管腔内未见分泌物增多（图1A）。少数大鼠个别支气管周围少量炎症细胞浸润（以淋巴细胞为主）。肺泡间隔狭窄，肺泡腔清亮宽敞，未见肺水肿、肺出血及肺气肿。模型对照组大鼠镜下可见个别大鼠支气管黏膜上皮少量脱落，纤毛不整，部分纤毛脱落；个别大鼠局灶黏膜皱襞轻度增多，管壁及平滑肌轻度增厚；管腔内未见分泌物增多；均见支气管周轻度炎症细胞浸润；肺泡间隔中度增厚或狭窄；轻、中度肺泡腔病理性扩大，少数肺泡壁断裂、融合成肺大泡，未见肺水肿和肺出血（图1B）。由表2可见，与正常对照组相比，模型对照组肺组织炎症细胞浸润，肺气肿病变显著（P＜0．05），其余指标未见明显变化；与模型对照组相比，通宣理肺片600 m g·kg－1、克咳片180和360 mg·kg－1对肺组织病理变化无明显影响，克咳片720 m g·kg－1可以减轻肺组织炎症细胞浸润（P＜0．05），其余指标均未见明显变化。

2．3 克咳片对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺功能的影响

表3结果显示，与正常对照组相比，模型对照组PEF值降低（P＜0．05），RI值延长（P＜0．05），Ti，Te和Cydn值均无明显变化。与模型对照组相比，通宣理肺片600 m g·kg－1可以延长Cydn值（P＜0．05），降低RI值（P＜0．05）；克咳片180，360和720 m g·kg－1均能降低RI值（P＜0．05），对Ti，Te和Cydn值无明显变化；克咳片720 m g·kg－1还能延长PEF值（P＜0．05）。

Tab．2 Effect of Keke tablets on pathological changes in lung tissue of aged rats with COPD

Tab．3 Effect of Keke tablets on respiratory function in aged rats with COPD

2．4 克咳片对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠血清肿瘤坏死因子α和白三烯含量的影响

表4结果显示，与正常对照组相比，模型对照组TNF-α和LTC4含量均增加（P＜0．05）。与模型对照组相比，通宣理肺片组、克咳片180，360和720 mg·kg－1均对COPD模型大鼠血清TNF-α含量无影响；通宣理肺片600 mg·kg－1、克咳片360和720 m g·kg－1均能降低LTC4含量（P＜0．05）。

Tab．4 Effect of Keke tab lets on serum content of tumor necrosis factor-α（TNF-α）and leukotriene（LTC4）in aged rats with COPD

3 讨论

炎症介质LTC4和TNF-α是加剧肺部炎症和COPD病理进程的重要因素。LTC4和TNF-α在有害颗粒或气体的刺激下，可经气道或肺组织的巨噬细胞、中性粒细胞等分泌产生，激活其他炎症细胞向病变组织聚集，释放更多的炎症介质，引起炎症介质的瀑布样连锁反应，导致氧化-抗氧化系统和蛋白酶-抗蛋白酶系统失衡，破坏气道、肺组织的基质和上皮，最终引起气道重构，肺功能下降［9］。现有研究表明，LTC4在COPD的病理进程中也起着重要作用，国内研究发现，COPD患者无论在急性发作期还是缓解期，血浆LTC4含量显著增高，他们推测LTC4与COPD患者的支气管黏膜炎症、支气管平滑肌收缩及气道重构有关［10］。

本研究结果表明，模型对照组大鼠LTC4和TNF-α均显著增高，RI显著增加，PEF显著下降，光镜下支气管黏膜上皮少量脱落，纤毛不整或部分脱落；局灶黏膜皱襞轻度增多，管壁及平滑肌轻度增厚；支气管周轻度炎症细胞浸润；肺组织肺泡间隔中度增厚或狭窄；轻、中度肺泡腔病理性扩大，少数肺泡壁断裂、融合成肺大泡。上述结果与宋一平等［8］报道的COPD模型具有支气管炎和肺气肿特征相一致，提示本研究COPD模型制备成功。另外，本研究采用通宣理肺片作为阳性对照药物，一则通宣理肺片的组成与克咳片的成分较相似，二则本研究集体前期研究采用了通宣理肺片作为阳性对照药物，显示出一定的抗炎和止咳作用［11］。本研究结果表明，通宣理肺片600 mg·kg－1能降低LTC4含量，延长Cydn值，降低RI值，进一步表明选用通宣理肺片作为阳性对照药物的可行性。

本研究结果表明，给予克咳片治疗后，克咳片180，360和720 mg·kg－1均可降低RI值，克咳片360和720 m g·kg－1可降低LTC4含量，克咳片720 m g·kg－1还可延长PEF值，减少肺炎症细胞浸润，提示克咳片对COPD具有一定的改善作用，其机制可能与降低LTB4分泌、从而改善肺部炎症细胞浸润有关。

本研究造模过程中大鼠死亡率较高，这可能与老年大鼠体质较差、在联合LPS和高强度的烟熏造模条件下导致大鼠肺功能衰竭有关。尽管采用老年大鼠可以更容易地制备COPD模型，但造模死亡率较高，而且老年大鼠不容易获得且价格昂贵。因此，在制备COPD动物模型时不宜选用老年大鼠。

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Therapeutic effect of Keke tablets in aged rats with chronic obstructive pulmonary disease

KUANG Shao-song1，2，YAN Jia-rong1，ZHONG Zhi-yong1，HUANG Xiao-qiong1，
LIU Sheng-lai1，TANG Xiao-jiang1
（1．Comparative Medical Laboratory，Guangdong Medical Laboratory Animal Center，Foshan 528248，China；2．College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510180，China）

OBJECTlVETo observe the therapeutic effect of Keke tablets on chronic obstructive pulmonary disease（COPD）．METHODSAged SD rats（14－16 months）were teated by smoking combined with endotracheally dripping lipopolysaccharides（LPS）for three times to establish the COPD model．The success rate of the COPD rat model was 53%till the 31st day following the preparation of the model．The 50 COPD model rats were randomly divided into COPD model-contro l，Tongxuanlifei tablets 600 m g·kg－1and Keke tablets 180，360 and 720 m g·kg－1groups and continued to smoke twice a day，60 min each time（interval of30 min）for30 d．At the same time，these rats were ig given corresponding drugs respectively for30 d．The serum levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α）and leukotriene C4（LTC4）were determined by means of commercial ELISA kits on the last day of the final drug treatment．The inspiratory time（Ti），expiratory time（Te），peak expiratory flow（PEF），dynamic lung compliance（Cydn）and airway resistance（RI）were measured by the testing systems of RC invasive airway resistance and lung compliance．In addition，the histological changes of lung were demonstrated by HE staining．RESULTSCompared with normal control group，the levels of TNF-αand LTC4 in the model control group were significantly increased（P＜0．05），PEF was significantly decreased（P＜0．05）and RI was extended（P＜0．05），but Ti，Te and Cydn had no obvious change．In addition，the pneumonia cells in filtrated to lung tissue and emphysema-like lesions were obvious．These results showed that the COPD rat model was established．Compared with model control group，Tongxuanlifei tablets 600 m g·kg－1significantly reduced the level of LTC4，extended Cydn and reduced RI（P＜0．05）；Keke tablets 180，360 and 720 m g·kg－1significantly reduced RI（P＜0．05），Keke tablets 360 and 720 mg·kg－1significantly reduced the level of LTC4（P＜0．05），and Keke tablets 720 m g·kg－1significantly extended the PEF（P＜0．05）and reduced the inflammatory cells in lung tissue．CONCLUSlONKeke tablets can improve COPD in aged rats．

Keke tablets；chronic obstructive pulmonary disease；model，animals

TANG Xiao-jiang，E-mail：river-t＠126．com，Tel：（020）81157336

R974

A

1000-3002（2014）01-0029-06

Foundation item：The project supported by Administration of Traditional Chinese Medicine of Guangdong Province（20112100）

2013-04-02 接受日期：2013-10-20）

（本文编辑：齐春会）

广东省中医药管理局资助项目（20112100）

邝少松（1973－），女，高级兽医师，博士研究生，主要从事动物疾病模型研究，Tel：（020）81157336，E-mail：kuangss＠126．com；唐小江（1967－），男，主任医师，博士，博士生导师，主要从事毒理学、药物和药理学研究。

唐小江，E-m ail：river-t＠126．com，Tel：（020）81157336