柚皮素止咳化痰平喘作用的研究

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(四川理工学院化学与制药工程学院,四川自贡 643000)

柚皮素是柚皮苷的苷元,属于二氢黄酮类化合物。柚皮素作为一类天然黄酮类化合物,主要存在于柑橘和葡萄柚中。Renugad[1]的研究表明柚皮素可以明显逆转镉诱导肝损伤大鼠的血清肝标记酶的活性而降低镉毒性和保护大鼠肝细胞的正常组织学结构;Jeon[2]实验证明柚皮素可以降低高脂饮食大鼠的总胆固醇、甘油三酯和动脉硬化指数,并增加高密度脂蛋白浓度而达到降脂的作用;Kanno[3]证明柚皮素对结肠癌Caco - 2具有细胞毒性作用,也可抑制小鼠肉瘤细胞S - 180的生长。而国内柚皮素的研究也被广泛关注。杨文青[4]的实验证明柚皮素可以改善阿尔茨海默病模型大鼠的认知能力。史莹[5]的细胞实验证明,柚皮素在体外可以抑制与哮喘病理发生有关的炎症因子。但柚皮素止咳、化痰、平喘作用的动物实验报道甚少,本实验通过建立相关动物模型,研究柚皮素的止咳化痰平喘作用。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

磷酸组胺 AR,上海源叶生物科技有限公司;柚皮素 上海金穗生物科技有限公司,批号:2013318;氢溴酸右美沙芬片 批号:121006,北京天衡药物研究所制药厂；昆明种小鼠 雌雄各半,体质量20±2g,SPF级,100只,购于重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司,许可证号:SCXK(渝)2007 - 0006。

豚鼠 雌雄各半,体质量(250±50)g,80只,购于重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司,动物合格证号:SCXK(渝)2012 - 0006；403C压缩雾化器 上海鱼跃医疗设备有限公司;756PC紫外可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;H - 1850R台式高速离心机 沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2实验方法

1. 2. 1 豚鼠筛选实验 80只豚鼠,正常饲养3d后开始实验,参考文献[6],实验前一天先做豚鼠筛选实验,即将豚鼠逐一关进容积为5L小动物密闭实验箱内,然后用压缩雾化器通过喷头将17. 5%枸橼酸水溶液喷入实验箱内,喷雾两分钟内不咳嗽者或记录5分钟内咳嗽次数少于10次者不用,直到筛选出20只适合做止咳实验的豚鼠,雌雄各半。再从剩余的60只豚鼠中,筛选出30只适合做平喘实验的豚鼠,雌雄各半,即将豚鼠逐一置于容积为5L小动物密闭实验箱,利用压缩雾化器将2mg/mL的磷酸组胺喷入实验箱内,150s内出现抽搐或跌倒的豚鼠被选用。

1. 2. 2 柚皮素对小鼠止咳实验 昆明种小鼠50只,雌雄各半,正常饲养3d后开始实验。小鼠禁食不禁水12h,称重,依据体质量随机分为5组,即正常对照组(生理盐水)、氢溴酸右美沙芬组(15mg/kg)、柚皮素低、中、高剂量组(10、20、40mg/kg);各组小鼠按照0. 1mL/10g每天灌胃给药,共7d。末次给药后30min,将每只小鼠放入500mL烧杯中,吸取0. 3mL浓氨水注入50mg棉球后放入烧杯内,到预定时间,立即将小鼠取出,观察其1min内典型的咳嗽反应(腹肌收缩或缩胸,同时张大嘴,有时可有咳声)。若1min内出现5次以上典型咳嗽者,算作"有咳嗽",反之,算作“无咳嗽”[6]。

按照序贯法[7]设计实验并计算出引起半数小鼠咳嗽的氨水刺激时间(EDT50),计算公式(1)为

式(1)

式中:n为动物数,C为r. x值的总和,r为每剂量动物数,x为剂量(即氨水刺激时间)的对数。求得各组EDT50后,再按公式(2)计算相对值R

式(2)

凡R值>130%算有镇咳作用,R值>150%算有明显镇咳作用,R值<130%无镇咳作用。

1. 2. 3 柚皮素对豚鼠止咳实验 将筛选合格的20只豚鼠禁食不禁水12h后称重,随机分为2组,即柚皮素低、高剂量组(7、28mg/kg),豚鼠灌胃的药物剂量根据种属间等效剂量折算法[8]计算确定。每天按照0. 1mL/10g灌胃给药,连续3d。在第一次给药前和末次给药后30min,将每只豚鼠置于容积为5L的小动物密闭实验箱中,用压缩雾化器通过喷头将17. 5%枸橼酸水溶液喷入实验箱内,持续15s,记录豚鼠咳嗽潜伏期(以第一次出现响亮咳嗽的时间作为潜伏期)和自喷雾5min内豚鼠出现响亮咳嗽次数,咳嗽潜伏期超过5min者,以5min计[6]。豚鼠咳嗽潜伏期延长率[9]按照公式(3)计算:

式(3)

1. 2. 4 柚皮素影响小鼠排痰实验 昆明种小鼠50只,正常饲养3d后开始实验。小鼠禁食不禁水12h,称重,依据体质量随机分为5组,即正常对照组(生理盐水)、氯化铵组(1000mg/kg)、柚皮素低、中、高剂量组(10、20、40mg/kg),各组小鼠按照剂量0. 1mL/10g每天灌胃给药,共7d。参考文献[9],末次给药后0. 5h,各组小鼠按剂量0. 1mL/10g腹腔注射5%的酚红溶液,注射后30min,将小鼠颈椎脱臼处死,仰位固定于手术板上,剪开颈前皮肤,分离气管,剥离气管周围组织,剪下甲状软骨下缘至气管分叉处之气管,用1%碳酸氢钠溶液2mL洗涤气管,将气管洗涤液按照酚红标准曲线的制备方法操作,在546nm波长处测定其吸收光度值A。根据酚红标准曲线的回归方程y=0. 2444x - 0. 014,R2=0. 9993,计算小鼠支气管洗液中酚红含量,并按照公式(4)计算化痰率。

式(4)

1. 2. 5 柚皮素对豚鼠平喘实验 将筛选合格的豚鼠30只禁食不禁水12h后称重,根据体质量随机分为3组,即正常对照组(生理盐水),柚皮素低、高剂组(7、28mg/kg),每天各组豚鼠按照0. 1mL/10g灌胃7d。第一次给药前和末次给药30min后,将各组豚鼠逐一置于容积为5L小动物密闭实验箱,利用压缩雾化器将2mg/mL的磷酸组胺喷入实验箱内,持续15s。记录豚鼠自喷雾开始出现哮喘的潜伏期(以第一次抽搐跌倒的时间作为潜伏期),引喘潜伏期超过5min者,以5min计[6]。豚鼠哮喘潜伏期延长率按照公式(5)计算:

式(5)

2 结果与讨论

2.1柚皮素对小鼠止咳实验

柚皮素对小鼠止咳实验结果见表1,由表1可见,与正常对照组比较,柚皮素低剂组小鼠EDT50有延长趋势(R=125. 9%),但无显著性差异,柚皮素的中剂和高剂组小鼠EDT50都显著性的延迟长(R=144. 5%,R=229. 1%),氢溴酸右美沙芬组小鼠EDT50也显著性的延迟长(R=234. 3%)。

2.2柚皮素对豚鼠止咳作用

柚皮素对豚鼠止咳实验结果见表2,由表2可见,与给药前比较,柚皮素低剂组可以显著性地减少自喷雾5min内枸橼酸引起豚鼠咳嗽次数(p<0. 01),对豚鼠咳嗽潜伏期的延长有增加趋势,但没有显著性差异,延长率为81. 2%;柚皮素高剂组组虽升可以显著性地延长豚鼠咳嗽潜伏期(p<0. 01),延长率为165. 3%,并减少自喷雾5min内枸橼酸引起豚鼠咳嗽次数(p<0. 01)。

表2 柚皮素对豚鼠止咳作用Table 2 The cough relieving effect of Naringenin on guinea pigs

注:#与给药前比较,##p<0. 01。

表1 柚皮素对小鼠止咳作用Table 1 The cough relieving effect of Naringenin on mice

咳嗽是由于呼吸道内分泌物或异物等刺激呼吸道粘膜,通过神经反射产生咳嗽动作,将呼吸道内分泌物排出[10]。

表4 柚皮素对豚鼠的平喘作用Table 4 The antiasthma effect of Naringenin on guinea pigs

注:*与正常对照组比较,* *p<0. 01;#与给药前比较,##p<0. 01。

本研究建立两种引咳动物模型,浓氨水对小鼠引咳模型和枸橼酸引咳豚鼠动物模型。这两种动物模型分别利用浓氨水和17. 5%枸橼酸刺激动物呼吸道粘膜而引发咳嗽,其机制是浓氨水和枸橼酸刺激动物气道粘膜时,兴奋了支气管壁上分布的对化学刺激敏感的无髓鞘C传入神经纤维,同时增加气道分泌物。柚皮素中、高剂量组对浓氨水引咳小鼠均有止咳效果,柚皮素高剂组还可以显著性地延长枸橼酸诱导豚鼠咳嗽潜伏期(p<0. 01),并减少咳嗽次数(p<0. 01),提示柚皮素可能阻碍了咳嗽反射弧中神经冲动的正常传导,而对浓氨水引咳的小鼠和枸橼酸引咳的豚鼠产生了良好的止咳作用。

2.3柚皮素影响小鼠排痰实验

柚皮素促进小鼠排痰实验结果见表3,由表3可见,与正常对照组比较,氯化铵组小鼠气管酚红含量显著性增加(p<0. 05),化痰率为151. 4%,柚皮素高剂组小鼠气管酚红含量也显著性增加(p<0. 05),化痰率为150. 9%。

咳嗽的诊断与治疗指南(2009版)[11]指出,急性支气管炎常伴有痰,痰是机体受到外界化学、机械或生物等刺激时,气道和支气管的腺体和杯状细胞分泌的产物,具有一定的保护作用,但粘稠的痰和因感染引起的脓痰会成为异物而刺激气道感受器而引起咳嗽。柚皮素高剂组与氯化铵组可以显著性地增加小鼠支气管酚红排出量(p<0. 05),且化痰率与氯化铵阳性对照组无显著性差异,说明柚皮素可以通过增加痰液排出而减轻小鼠咳嗽症状。

表3 柚皮素对小鼠排痰的影响 Table 3 The expectoration effect of Naringenin on mice

注:*与正常对照组比较,*p<0. 05。

2.4柚皮素对豚鼠平喘作用实验

柚皮素对豚鼠平喘作用实验结果见表4,由表4可见,与正常对照组比较,柚皮素高剂组可以显著性地延长豚鼠由于磷酸组胺诱导哮喘出现的潜伏期(p<0. 01);与给药前比较,柚皮素高剂组可以显著性地延长豚鼠哮喘潜伏期(p<0. 01),延长率为242. 2%,正常对照组、柚皮素低剂组豚鼠呈现哮喘潜伏期延长的趋势,但没有统计学意义,可能与豚鼠体重增加,对再次磷酸组胺刺激敏感性降低有关。

本实验用2mg/mL的磷酸组胺诱发豚鼠哮喘,其机制王山泽[12]证明磷酸组胺可以兴奋支气管平滑肌上的H1 - R,H1 - R可引起气道和消化道平滑肌收缩,皮肤风疹块,增加呼吸道粘液分泌,使毛细血管内皮细胞粘合变疏松而致水肿,并可引起低血压和心律失常,故豚鼠出现呼吸困难、抽搐跌倒等哮喘的症状。而哮喘是由于免疫学异常所致的慢性炎症疾病,其发生与嗜酸性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞等多种炎症、非炎症细胞及炎性介质关系密切。Makinde T[13]的研究表明,在哮喘病理生理过程中,转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF - β1)在炎症的发生和气道重塑中起重要作用,TGF - β1可以延长一些免疫炎性细胞的存活期而参与气道炎性反应,还可以通过调节相关蛋白基因的表达而导致纤维沉积引起气道重塑[14 - 15]。史莹[5]的体外细胞实验表明,柚皮素是通过抑制Smad2 磷酸化而使TGF - β1的信号无法正常转导,从而影响了TGF - β1的生物功能。实验设计用磷酸组胺诱发豚鼠哮喘发生,豚鼠经过柚皮素7d的治疗干预,可以显著地延长磷酸组胺诱发哮喘的潜伏期,可能与柚皮素在体内也抑制TGF - β1的产生有关,从而减少了呼吸道炎性细胞的产生,减轻豚鼠哮喘症状,但还需进一步实验证明。

3 结论

3.1柚皮素可以延长引起半数小鼠咳嗽的氨水喷雾时间(EDT50),且呈剂量依赖性;柚皮素低剂组(7mg/kg)可以显著性地减少枸橼酸引起豚鼠咳嗽次数,但对豚鼠咳嗽潜伏期的延长仅有增加趋势,柚皮素高剂组(28mg/kg)可以显著性地延长枸橼酸诱导豚鼠咳嗽的潜伏期,并减少咳嗽的次数,与氢溴酸右美沙芬的作用相似;提示柚皮素可能阻碍了小鼠和豚鼠咳嗽反射弧中神经冲动的正常传导而产生止咳作用。

3.2柚皮素高剂组(28mg/kg)可以增加小鼠气管酚红排出量,作用与氯化铵相似,提示柚皮素可以通过促进小鼠痰液的排出而减轻咳嗽症状。

3.3柚皮素高剂组(28mg/kg)可以显著性地延长磷酸组胺诱导豚鼠哮喘发生的潜伏期,从而减轻豚鼠哮喘症状,其机制可能是柚皮素在体内抑制了TGF - β1的产生而减少呼吸道炎性细胞的产生,但还需进一步实验证明。

综上结果提示,柚皮素具有良好的止咳化痰平喘作用,为柚皮素的开发利用提供实验依据。

[1]Renugad evi J,Prabu SM. Cadmium - induced hepatotoxicity in rats and the protective effect of naringenin[J]. Exp Toxicol Pathol,2010,62:171 - 181.

[2]Jeon Sm,Kim Hk,Kim Hj,etal. Hypocholesterolemic and antioxidative effects of naringenin and its two metabolites in high- cholesterol fed rats[J]. Translational Research,2007,149(1):15 - 21.

[3]Kanno S,Tomizawa A,Hiura T,etal. Inhibitory effects of naringenin on tumor growth in human cancer cell lines and sarcoma S - 180 - implanted mice[J]. Biol Pharm Bull,2005,28(3):527 - 530.

[4]杨文青,马晶,余华荣. 柚皮素改善阿尔茨海默病模型大鼠的认知能力及其机制研究[J]. 中草药,2013,44(6):715 - 720.

[5]史莹,谷伟,孙丽华,等. 柚皮素对支气管上皮细胞中Smad介导的TGF - β1通路的影响[J]. 南京医科大学学报：自然科学版,2013,33(2):155 - 159.

[6]陈奇. 中药药理研究方法学(第三版)[M]. 北京:人民卫生出版社,2011:613 - 622.

[7]刘宾,江南. 序贯法研究甘草酸二铵对小鼠镇咳作用[J].中国医院药学杂志,2009,29(10):820 - 822.

[8]魏伟,吴希美,李元建. 药理实验方法学(第4版)[M]. 北京:人民卫生出版社,2010:1698.

[9]包桂兰,杜智敏,赵中华,等. 五味沙棘散止咳祛痰平喘作用的实验研究[J]. 现代中西医结合杂志,2009,18(3):243 - 247.

[10]邱忠民. 慢性咳嗽诊断和治疗的进展[N]. 同济大学学报：医学版,2005,26(1):9 - 14.

[11]中华医学会呼吸病学分会哮喘学组. 咳嗽的诊断与治疗指南[J]. 全科医学临床与教育,2009,7(5):453 - 456.

[12]王山泽,邓琨. 组织胺受体与支气管哮喘[J]. 国外医学呼吸系统册,1990,10(3):113 - 116.

[13]Makinde T,Murphy RF,Agrawal DK. The regulatory role of TGF - beta in airway remodeling in asthma[J]. Immunol Cell Biol,2007,85(5):348 - 356.

[14]Black PN,Young PG,Skinner SJ. Response of airway smooth muscle cells to TGF - beta l:effects on growth and synthesis of glycosaminoglycans[J]. Am J Physiol,1996,271:910 - 917.

[15]Samarakoon R,Higgins PJ. Integration of non - SMAD and SMAD signaling in TGF - beta1 - induced plasminogen activator inhibitor type - 1 gene expression in vascular smooth muscle cells[J]. Thromb Haemost,2008,100(6):976 - 983.