绿茶下脚料中EGCG的分离与体外抗氧化性能研究

李邦玉，刘 臣，陈 萌，陈 柳，俞 晟，王耀荣

（1.苏州市职业大学应用化学研究室，江苏苏州 215104;2.苏州大学材料与化学化工部，江苏苏州 215123）

化学家从茶叶中分离出茶多酚后发现其具有优良的抗氧化性，特别是其中儿茶素类化合物具有很活泼的羟基氢，能提供大量的氢质子与自由基反应，有效地清除人体内过剩的活性氧自由基和抑制脂质过氧化，具有显著的抗衰老保健作用［1］。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是儿茶素中的主体成份，自从1929年人们从茶叶中提取分离出来后，许多科学工作者对EGCG生理功效进行了研究，发现EGCG具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗衰老、抗菌消炎、降糖和降压等多种生物学功能［2］，所以其被广泛应用于食品、药品和饮料行业。

本实验选用食用级溶剂作为EGCG的提取纯化溶剂，采用安全、经济的聚酰胺树脂分离纯化方法，制备适用于食品、化妆品、医疗、保健用的EGCG产品。该方法简便可靠，可以应用于工业化大生产，使得绿茶的下脚料得到合理的应用。采用紫外可见光谱法对EGCG的温度稳定性、EGCG与DPPH·的反应等进行了初步探索，从光谱图的变化直观地判断体系的内部反应，粗略得到EGCG体外抗氧化的温度条件，获得跟踪EGCG与DPPH·反应的检测波长。以VC等常见抗氧化剂为参照系，采用邻苯三酚自氧化法研究了EGCG对·的清除能力，采用DPPH·法研究了EGCG体外抗氧化活性，初步判断EGCG是一个很好的天然抗氧剂。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

DPPH· sigma公司;聚酰胺薄膜层析板 台州市路桥四甲生化塑料厂;聚酰胺树脂 60～100目，沧州宝恩吸附材料科技有限公司;三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐 上海如吉生物科技发展有限公司;茶多酚 南京仁信化工有限公司;邻苯三酚，乙酸乙酯等其他试剂 均为国产分析纯;绿茶的下脚料 苏州东山碧螺春茶厂提供。

P230型高效液相色谱仪 配有P230+紫外检测器、P230/P230p高压恒泵，EC2000色谱工作站，大连依利特分析仪器有限公司;RUC－5200型超声波清洗机 上海睿祺公司;不锈钢循环水多用真空泵 上海沪西分析仪器厂;RE52－3旋转蒸发仪 上海沪西分析仪器厂;玻璃层析柱 400mm×15mm，定制;UV1801紫外可见分光光度仪 北京坤健捷诚科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 EGCG的分离提纯 取绿茶下脚料10g，置250mL容量瓶中，加入95%乙醇150mL，80℃超声（工作频率24kHz，功率300W）提取30min，提取两次，合并提取液，过滤，80℃减压回收乙醇，得浓缩液上聚酰胺树脂柱，以乙醇－醋酸梯度洗脱，薄层层析跟踪检测，收集EGCG部位流分，脱色，浓缩，重结晶，得 EGCG纯品，液相色谱法检测产品成分与纯度。

利用液相色谱法分析产品纯度及含量。色谱条件为:色谱柱:Shimpak C18（4.6mm ×150mm，5μm）;流动相:甲醇－水－冰醋酸（20∶80∶0.2）;检测波长:280nm，流速:1.0mL·min－1;柱温:30℃，进样量 5μL。

1.2.2 不同温度下EGCG紫外可见吸收光谱图的测定 在10mL比色管中盛5mL同一浓度的EGCG溶液，分别置于 20、40、60、80℃ 水浴锅中恒温加热30min，在200～600nm范围内扫描样品的紫外可见吸收光谱。

1.2.3 选择 EGCG与 DPPH·反应的扫描波长实验 按表1方案吸取不同浓度的EGCG乙醇溶液加入直径1cm比色皿中，再加入3.5mL 0.0176g/L DPPH·乙醇溶液，室温避光静置20min后，以50%乙醇作参比，在200～600nm范围内扫描样品的紫外可见吸收光谱。

表1 EGCG与DPPH·反应加样表Table 1 The scheme of the reaction of EGCG with DPPH·

1.2.4 EGCG清除DPPH·能力测定

1.2.4.1 溶液的配制 DPPH·标准储备液:准确称取20mg DPPH·用无水乙醇定容于250mL容量瓶中，得到浓度为2×10－4mol/L的DPPH·溶液，贴上标签，暗处保存。

DPPH·标准应用液:取DPPH·标准储备液用无水乙醇定容，制备0.0176g/L DPPH·标准应用液，贴上标签，暗处保存。

1.2.4.2 DPPH·标准曲线的绘制 分别从0.0176g/L DPPH·标准应用液中取0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mL 于比色管中，添加无水乙醇至10mL，配成浓度分别为3.52、7.04、14.08、28.16、56.32μg/mL 溶液。在 517nm波长测定不同浓度DPPH·的吸光度值，绘制其标准曲线。

1.2.4.3 EGCG清除DPPH·能力测定 参考Larrauri等［3－5］的方法进行清除自由基实验。按表2方案吸取不同浓度的EGCG乙醇溶液加入直径1cm比色皿中，再加入3.5mL 0.0176g/L DPPH·乙醇溶液，室温避光静置20min后，以50%乙醇作参比，于517nm处测定其吸光值。按以下公式得出其清除率:

清除率（%）=［1－（A－B）/A0］×100

表2 EGCG清除DPPH·实验加样表Table 2 The scheme of the reaction of EGCG with DPPH·

抑制百分数（%）=［（A0－A）/A0］×100

式中:A0为邻苯三酚的自氧化速率;A为加入样液后邻苯三酚的自氧化速率;单位均为吸光度每分钟的增值。

2 结果与讨论

2.1 EGCG的分离纯化及检测

2.1.1 EGCG的分离提纯 随着EGCG应用领域越来越广泛，对其提取纯化制备技术也提出了更高的要求。要使EGCG能够极大程度地发挥医疗、保健作用，需要一种安全、经济的EGCG提取纯化方法，能够保证EGCG原料的质量稳定、安全可控。因此，本实验选用食用级的95%乙醇溶剂作为EGCG的提取纯化溶剂，用超声萃取绿茶下脚料，过滤，减压，浓缩液上安全、经济的聚酰胺树脂柱分离纯化，以乙醇－醋酸梯度洗脱，薄层层析跟踪检测（如图1所示），发现乙醇与醋酸体积比为1∶4时洗脱效果最好。收集EGCG流分，脱色，浓缩，重结晶，得 EGCG纯品。方法简便，可以应用于工业化大生产，使绿茶的下脚料作为资源得到合理运用。

图1 EGCG馏分薄层色谱跟踪图Fig.1 Thin layer chromatogram of the extracted EGCG products

2.1.2 液相色谱法检测EGCG产品成分及含量纯化的样品及EGCG对照品色谱如图2、图3所示。由纯化样品的液相色谱图可知，EGCG较纯，含量大于97%，只混有极少量其它杂质。提取收率达到12%。

图2 纯化样品的液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of the extracted EGCG products

图3 EGCG对照品液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of EGCG standard reagent

2.2 紫外可见吸收光谱法考察EGCG受温度的影响

由图4可知EGCG在276nm处有特征吸收。

实验考察了温度对EGCG的影响。由图5可知，温度升高到40℃后吸收曲线就发生变化了，当温度升高到60℃后就破坏了EGCG的结构，225nm处吸收峰分裂且强度骤降，276nm处吸收峰消失，而在325nm处的吸收峰变强。吴平等［6］报道在高温下，EGCG可能发生降解、异构化、脱没食子酸化和自动氧化等反应，随着EGCG的下降，有GA的产生，而其异构体GCG也明显增加。所以EGCG在高温下容易变质，应在合适的低温如室温下考察其抗氧化性能。

图4 EGCG紫外可见光谱扫描图Fig.4 UV visible spectroscopy of EGCG

图5 温度对EGCG紫外可见光谱影响图Fig.5 UV visible spectroscopy of EGCG under different temperature conditions

2.3 EGCG对DPPH·的清除能力测定

2.3.1 EGCG与DPPH·反应的扫描波长选择 从DPPH·在无水乙醇中的光谱图6中可见，DPPH·在326nm和517nm处出现两个特征吸收。

图6 DPPH的紫外可见吸收光谱图Fig.6 UV visible spectroscopy of DPPH·

EGCG能使紫红色DPPH·溶液褪色，表明EGCG与DPPH·发生了反应。实验中尝试用EGCG与DPPH·发生反应后体系的紫外可见光谱图来跟踪该反应。如图7所示，EGCG在517nm处没有吸收，而DPPH·中添加了EGCG后，其吸收光谱图发生了明显变化，在326nm和517nm处两个特征吸收都失去了特征性，在425nm处出现新的宽吸收峰。

图7 EGCG与DPPH·反应中光谱变化图Fig.7 UV visible spectroscopy changes of the reaction system of EGCG with DPPH·

同时，不同浓度的EGCG与DPPH·发生反应后体系的紫外可见光谱图如图8所示，除了发现反应体系的图谱与DPPH·的吸收光谱图不同之外，体系的光谱在DPPH·517nm处吸收强度随EGCG浓度的增大而有规律地依次降低。而DPPH·另一特征吸收326nm处的吸收强度变化没有规律性，所以通常借助517nm处的吸收强度变化来评价物质的抗氧化活性［7］。实验比较了VC和茶多酚分别与DPPH·反应后体系的紫外可见光谱图，发现上述两个反应体系的图谱变化规律类似于EGCG与DPPH·反应体系的光谱变化规律。通过紫外可见光谱法初步探讨了DPPH·与温度的关系，如图9所示。温度升高，DPPH·自由基的颜色明显褪去。从图9上可知不同温度下的光谱图差别很大，517nm处的特征吸收强度逐渐降低，而425nm宽峰处吸收强度逐渐增强，326nm处特征吸收没有太大变化。所以温度过高使得517nm处特征吸收消失，不利于利用517nm处的吸收强度变化来评价物质的抗氧化活性。

图8 不同浓度的EGCG与DPPH·发生反应后体系的光谱图Fig.8 UV visible spectroscopy of the reaction system of different concentrations EGCG with DPPH·

总之，在讨论抗氧化剂消除DPPH·的反应时，应选择517nm波长监测，同时在较低温度如室温下进行。

2.3.2 DPPH·标准溶液的标准曲线 利用DPPH·在无水乙醇中的517nm处的特征吸收，绘制DPPH·标准曲线，得出DPPH·标准曲线的回归方程为Y=0.0151+0.0281x（R=0.999909），如图10所示。在0～60μg/mL范围内DPPH·乙醇溶液浓度与吸光度值之间呈现良好的线性关系。

图9 DPPH·在不同温度下紫外可见光谱图Fig.9 UV visible spectroscopy of DPPH·under different temperature conditions

图10 DPPH·标准溶液的标准曲线Fig.10 Standard curves of DPPH·standard solution

2.3.3 EGCG清除DPPH· 图11是EGCG对DPPH·清除效果图。由该图可知，EGCG对DPPH·有很强的清除作用，清除率随EGCG浓度的增加而上升，在EGCG浓度为32μg/mL时清除率达到80%，其IC50值约为12μg/mL。同时，用茶多酚、维生素C标准品做比较实验，发现EGCG的清除效果比VC好，但不如市售茶多酚，可能是市售茶多酚里面不仅含有EGCG，还含有其他成分，某些成分的清除效果应比EGCG还好。

图11 EGCG对DPPH·自由基清除图Fig.11 Scavenging effects of EGCG on DPPH·

图12 EGCG对·清除图Fig.12 Scavenging effects of EGCG on ·

3 结论

本文成功地从绿茶下脚料中提取出了纯度很高的EGCG单体。EGCG在低温如室温下比较稳定，适宜考察其抗氧化性能。在室温等低温下于517nm波长处监测抗氧化剂EGCG清除DPPH·的性能比较合适。EGCG对自由基有较强清除作用，清除DPPH·、·的能力比维生素C强，其清除上述两类自由基的IC50值分别为 12μg/mL 和 5.9μg/mL。总之，EGCG是一种较好的天然抗氧化剂。

［1］邬新荣，王岳飞，张士康，等.茶多酚保健功能研究进展与保健食品开发［J］.茶叶科学，2010，30:501－505.

［2］Jane V，Higdon B F.Tea catechins and polyphenols:health effects，metabolism，and antioxidant functions［J］.Crit Rev Food Science and Nutrition，2003，43（1）:89－143.

［3］Larraufi J A，Sanchez M C，Saura C F.Effect of temperature on the free radical scavenging capacity of extracts from red and white grape pomaee peels［J］.J Agic Food Chem，1998，46（7）:2694－2697.

［4］刘朝霞，胡士德，邹坤，等.资木瓜乙醇提取物的体外抗氧化活性研究［J］.三峡大学学报:自然科学版，2008，30（4）:72－75.

［5］李红，张元湖.应用DPPH·法测定苹果提取物的抗氧化能力［J］.山东农业大学学报:自然科学版，2005，36（1）:35－39.

［6］吴平.表没食子儿茶素没食子酸酯的热稳定性研究［D］.合肥:安徽农业大学，2011:2－4.

［7］余芳，安辛欣.富硒绿茶中茶多酚及水提物的抗氧化活性研究［J］.江苏农业科学，2012，40（8）:298－300.