假蜜环菌固体发酵及其产物提取工艺的优化研究

余育兵， 宋 淼， 张书祥

(安徽大学 生命科学学院， 合肥 230039)

假蜜环菌 [Armillariellatabescens(Scop.ex Fr.)Sing]属真菌门，担子菌纲，伞菌目，白蘑科，蜜环菌属。假蜜环菌又名“亮菌”。 该菌能治疗急、慢性肝炎、胆囊炎、胃炎等[1]，有显著提高机体免疫机能的功效[2]。

合肥诚志生物制药有限公司采用体积为800 mL能进行空气过滤的塑料瓶，或体积相当的广口玻璃瓶作为发酵装置，装入糊化后的玉米粉、山芋粉等作为假蜜环菌发酵培养基，经灭菌、冷却后，接入菌种，26 ℃培养50～60 d。该工艺的特点是发酵生产周期长[3]。本研究通过在假蜜环菌固体培养基中添加稻草、稻糠、花生壳，改善培养基的通透性，提高菌体生长速率，达到缩短发酵周期，提高产量的目的。有关假蜜环菌固体发酵培养基的优化，鲜见文献报道。

假蜜环菌的发酵代谢产物包括多糖、多肽、亮菌甲素、亮菌乙素等有效成分。提取固体发酵培养基里的多糖成分，是制备口服液成品的关键步骤之一。目前，假蜜环菌多糖的提取方法有热水浸提法、酸提法、碱提法、有机溶剂提取法、酶法等。假蜜环菌多糖属于水溶性多糖，用热水浸提法，操作简单、成本较低[4]，正被诚志公司所采用。本文通过单因子和正交实验对热水浸提法的提取工艺进行探讨[5]。以上两方面研究，旨在为该公司现行的生产工艺改进提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌种

假蜜环菌，由合肥诚志生物制药有限公司提供。

1.1.2 主要实验试剂、器皿

玉米粉、山芋粉，800 mL塑料瓶由诚志公司提供。花生壳、稻草、稻糠购自合肥郊区农户。

1.2 主要实验仪器

UV-5200 紫外分光光度计为上海元析仪器有限公司产品；YP-5002型电子天平为上海越平科学仪器有限公司产品；DHP-9162型电热恒温培养箱为上海一恒科技有限公司产品，HH-S4型数显恒温水浴锅为金坛市金南仪器制造有限公司产品，SX-700压力蒸汽灭菌锅为TOMY公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵生产工艺的优化

按照诚志公司提供的培养基配方，配制固体发酵培养基时，向培养基内分别加入2%(W/V)等质量的花生壳、稻糠、稻草，121 ℃，0.105 MPa，灭菌40 min后，冷却到适当温度，接入假蜜环菌固体种子，26 ℃培养50 d，每个样设置3个重复。假蜜环菌菌丝由培养基表面向下伸展，观察菌丝生长速率，检测发酵产物含量，以不加添加物的原培养基发酵结果作为对照。

1.3.2 多糖及蛋白质含量检测方法

1)样品、对照样多糖含量测定。多糖含量测定采用苯酚硫酸法测定吸光值，根据标准曲线得到多糖浓度，再计算出多糖含量[6，7，9]。

2)样品、对照样蛋白质含量测定。以考马斯亮蓝染料法，测定固体发酵样品液的吸光值，根据标准曲线计算出蛋白质含量[8，9]。

1.3.3 假蜜环菌多糖提取工艺的优化

1)热水浸提法提取假蜜环菌多糖[3，9]，详见参考文献。

多糖提取率(%)=(多糖质量/原料质量)×100%

2)单因子实验。影响热水浸提法提取多糖得率的因素有提取时间、提取温度、料液比、提取次数、温度、pH值等。本实验采取两次提取，对提取时间、提取温度、料液比三因素进行单因子研究。

3)正交试验设计[10]。根据上述单因子试验所得到的结果，设计三因素三水平的正交实验，对实验结果进行极差分析。所设计的因素水平，如表1所示。

表1 多糖提取正交试验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 固体发酵培养基的优化结果

假蜜环菌种子分别接到含有添加物及对照培养基表面后，放置26 ℃培养箱培养，观察菌丝体向发酵培养基中伸展情况，并记录，结果见表2。

表2 在不同添加物的培养基中假蜜环菌菌丝生长情况

由表2可见，培养到20 d左右，添加有稻糠、稻草、花生壳的培养基菌丝生长速度均快于对照样，其中，长势更快的是添加了花生壳的实验瓶。培养到35 d左右，菌丝体基本布满培养基，菌丝体已吐浆(分泌出褐色的代谢产物)，其中，最先开始吐浆的是添加有稻糠培养基的实验瓶，接着是添加花生壳、稻草的培养基，最后的是无添加物的对照组。培养42 d左右时，有添加物的培养基颜色已经变成褐色，显示发酵完成。而无添加物对照样，发酵尚未完成。

发酵完成后，测定样品及对照样培养基中的多糖及蛋白质含量，结果见表3。由表3可知，多糖含量相对较高的是添加花生壳的培养基，其次是添加稻草、稻糠的培养基。蛋白质的含量相对较高的是添加稻草的培养基，其次是添加花生壳、稻糠的培养基。

表3 不同添加物的培养基代谢产物含量

通过观察发酵过程菌丝体的生长状况并检测发酵产物有效成分含量，发现添加稻糠、稻草、花生壳，可以改善培养基的通气性，促进菌丝生长，缩短发酵周期。在3种添加物中，以花生壳作为添加物更佳。这可能是因为添加花生壳的培养基膨松度要好于其他两种。

2.2 假蜜环菌多糖提取工艺的优化

2.2.1 单因子试验结果

1)提取时间对多糖提取率的影响。由表4可知，取料液比为1∶5，提取温度为80 ℃，在一定范围内，随着热水提取时间的延长，亮菌的多糖提取率随之有所提高，在热水提取3.0 h之前提取率上升的较为明显，随着提取时间再延长，亮菌多糖的提取率不再增加。而是呈现下降趋势。可见，提取时间选3.0 h相对较好。

表4 提取时间对多糖提取率的影响

表5 提取温度对多糖得率的影响

表6 料液比对多糖得率的影响

2)提取温度对假蜜环菌多糖提取率的影响。由表5可知，在提取时间为3.0 h，料液比为1∶5的条件下，在80 ℃之前，随着提取温度的升高，多糖提取率也随之提高，在提取温度为80 ℃时，多糖的提取率达到最高。当温度继续提高，多糖的提取率稍有下降，因此，提取温度选择80 ℃较为适宜。

3)料液比对假蜜环菌多糖提取率的影响。在提取时间为3.0 h，提取温度为80 ℃，当料液比为1∶5时，多糖的提取率达到最大值3.1%。再随着提取液的体积的增大，多糖的提取率不再增加。因此，选择料液比为1∶5为好。

2.2.2 正交实验结果

根据上述单因子试验所得到的结果，进行了三因素三水平的正交实验，实验结果见表7。

由表7可知，极差R值的大小顺序为B>C>A，这就表明，因素B对假蜜环菌多糖提取的影响最大，也就是提取时间对提取亮菌多糖的影响要大于提取的料液比和提取温度。假蜜环菌的粗多糖提取率的最佳水平为A3B2C1，即在提取温度为85 ℃，料液比为1∶4的条件下，提取3.0 h时假蜜环菌多糖的提取率最高。

表7 正交试验结果

3 结论

1)在工业大生产中，假蜜环菌固体发酵培养基中添加2%(W/V)稻糠、稻草、花生壳，比传统的无添加物的培养基菌丝体生长加快，代谢产物的含量稍有增加。就3种添加物来说，添加花生壳，发酵效果更佳。

2)假蜜环菌多糖的提取是工业生产工艺中的一个重要环节，在多糖提取过程中，导致提取时间较长而且提取的不够完全的主要原因是菌丝内有紧密的胞壁结构[11]，本研究结果表明，当提取工艺条件为：温度85℃、料液比为1∶4、时间3.0 h时，提取效果相对较好。

参考文献：

[1]沈业寿，马金宝．亮菌研究的现状与展望[J]．安徽大学学报，2007，31(1)：82-86.

[2]Kiho T, Shiose Y, Nagai K, et al. Polysaccharides in fungi. XXIX. Antitumor and immunomodulating activities of two polysaccharides from the fruiting bodies ofArmillariellatabescens[J]. Chem Pharm Bull(Tokyo), 1992, 40(8): 2110-2114.

[3]凌庆枝，袁怀波，王妮娜，等．亮菌固态和液体发酵多糖及其醒酒作用研究[J]. 食品科学，2008，29(5)：324-326.

[4]罗 袆，李 东．香菇多糖的研究进展[J]. 食品与发酵工业，2000，26(4)：63-66.

[5]黄燕，罗 强，胥成浩，等．固体发酵蜜环菌多糖提取工艺的研究[J]. 四川食品与发酵，2005，41(2)：26-28.

[6]张惟杰．复合多糖生化研究技术[M]. 上海：上海科技出版社，1987.

[7]宋群亮，张 平，孙旭群，等．亮菌多糖的苯酚-硫酸比色法含量测定[J]. 安徽医药，2007，11(6)：512-513.

[8]肖嫩群，刘洪娜，张华玲，等．固态发酵生产蜜环菌饮料[J].食品与发酵工业，38(7)：212-215.

[9]宋 淼，张书祥，王 清．假蜜环菌液体种子的制备及其应用研究[J]. 生物学杂志，2012，29(5)：64-67.

[10]张 平，宋群亮，李绍平，等．正交实验优选亮菌多糖的提取工艺[J]. 中国药师，2007，10(4)：324-326.

[11]高 婷. 亮菌发酵工艺、亮菌多糖及药效学研究[D]. 成都：四川大学，2005，32.