动物microRNA靶基因的筛选与鉴定研究进展

刘 悦，李 丹，张 玉，王 婵，盛 清，吕正兵，陈 健，张耀洲，聂作明

(1. 浙江经贸职业技术学院应用工程系，杭州 310018；2. 浙江理工大学 生命科学学院，杭州310018)

microRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸的小分子非编码RNA。miRNA可以通过与靶基因mRNA的靶位点结合，抑制蛋白的合成或诱导该基因mRNA降解，从而参与基因的表达调控[1]。miRNA 在各种生物中普遍存在，现已从线虫、果绳、家鼠、人体、家蚕及拟南芥等生物中分离到了miRNA[2]。查询专业的miRNA数据库miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/, Release 20.0)得知，目前已经发现并验证的miRNA前体序列达到24521条，成熟miRNA序列30424条[2]，涉及到206个物种，主要包括后生动物和被子植物，另外病毒、囊泡藻界和粘菌虫类生物也有少量发现。miRNA基因的转录独立于其它基因，并不翻译成蛋白质，而是在体内代谢过程中起多种调控作用，是越来越受关注的转录后调控网络中重要的调控因子。

1 miRNA的基因调控功能

miRNA主要在转录后水平调控基因的表达。成熟miRNA结合到包含Argonaute (AGO)等蛋白的核糖核蛋白复合物中形成miRNA诱导的沉默复合体(miRNA-induced silencing complex，miRISC)，从而介导特异mRNA靶标的转录后基因沉默。miRNA和miRISC复合体主要通过两种方式调控靶基因的表达，一种是通过碱基非完美互补结合靶基因mRNA，阻碍翻译过程，但mRNA水平维持不变；另外一种是完美互补结合靶基因mRNA，影响靶基因mRNA的稳定性或降解mRNA，从而间接调控生物的生长发育[3]。miRNA通过调控靶基因的表达行使生物学功能，已经确定的miRNA功能涉及到生物的分子免疫机制、生长与发育调控、干细胞的分化、细胞的信号转导、肿瘤发生以及各种疾病和病毒感染等[4-6]。这些研究表明，miRNA在生物体的生长发育过程中起到重要的调控作用。

动物源miRNA主要通过与靶基因mRNA的3′端非编码区域(3′UTR)互补匹配导致靶基因mRNA的翻译受到抑制，从而调控靶基因的表达。miRNA靶基因预测表明，脊椎动物中受miRNA调控的基因大约至少占所有基因的20%～30%[7-9]，在miRNA靶基因专业数据库TarBase5.0中(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/)，通过实验验证的 miRNA靶基因相关记录只有1300多条，而在2012年最新版的TarBase 6.0中，通过实验验证的 miRNA靶基因相关记录却达到了65814条[10]，已知靶基因数量的快速增长表明，miRNA靶基因的鉴定成为miRNA功能研究的关键。由于miRNA靶基因的表达往往很低，同时鉴定的实验方法较为烦琐，实验操作难度较高，导致至今确定的miRNA靶基因数量不多。近年来，基于miRNA和靶基因作用原理，出现了很多新的靶基因筛选方法，为miRNA功能研究提供了越来越多的技术手段[11-13]。植物miRNA主要包括降解组测序法，而动物miRNA靶基因鉴定的方法研究较多，主要包括生物信息学方法、差异表达谱方法和近年来出现的miRISC免疫沉淀法。

2 microRNA靶基因的筛选与鉴定的研究方法

2.1 生物信息学方法

早期的miRNA靶基因鉴定一般从靶基因的预测开始。动物源miRNA主要通过与靶基因mRNA的3′UTR碱基互补结合，从而调控靶基因的表达，因此动物源miRNA的靶位点主要位于靶基因mRNA的3′UTR，同时这些区域往往包含多个miRNA的多个靶位点，这些靶位点往往具有物种间保守性，且无明显二级结构(图1所示)。根据以往的实验数据统计分析，已知的miRNA与靶基因的结合方式主要分为3种：1)5′端主导型：miRNA种子序列(miRNA 5′端第2～8个碱基区域)和3′端一些连续的碱基与靶基因完全互补；2)5′端种子主导型：miRNA种子序列和3′端有限的一些碱基和靶基因完全互补；3)3′端互补型：miRNA 序列3′端碱基和靶基因发生不完全互补配对，同时有个别配对向种子区延伸[14]。根据miRNA和靶基因的这3类结合方式以及靶位点的保守性，严格限制预测条件，我们可以预测潜在的miRNA靶基因[14]，然后通过实验验证这些靶基因。但预测miRNA靶基因首先必须获得该物种基因的3′UTR数据库，这使得那些基因数据库不全的物种无法通过生物信息学方法预测miRNA靶基因。另外有研究表明，存在少量的miRNA靶基因，其靶位点位于靶基因的编码区或5′UTR区，且主要降解mRNA，同时有些miRNA和靶位点的结合并不完全遵守“种子规则”，而且没有物种间的保守性[15-17]，这使得生物信息学无法预测很多“规则”以外的靶基因。另外，预测得到的很多候选靶基因经实验验证并不是真正靶基因[18]，表明利用生物信息学方法预测miRNA靶基因假阳性太多，这为后面的实验验证带来很大的困难，因此生物信息学方法鉴定miRNA靶基因具有一定的局限性。

2.2 差异表达谱分析法

差异表达谱分析法分为差异转录组分析法和差异蛋白组分析法(图1所示)。差异转录组分析法先上调或下调细胞中miRNA，然后通过基因表达谱芯片分析细胞中基因的差异表达，从而获得候选miRNA靶基因[19, 20]。该方法只能鉴定被miRNA作用导致mRNA降解的靶基因，假阳性较高。蛋白组学分析法基于miRNA调控靶基因的蛋白水平，通过氨基酸同位素标记培养的方法获得miRNA介导的蛋白差异水平，从而获得相应的靶基因[21, 22]。该方法也可能存在一定的假阳性，且实验难度较大。差异表达谱分析法由于假阳性较高，因此使用较少。

2. 3 miRISC免疫共沉淀法

miRISC免疫沉淀法基于miRNA和靶基因的作用原理(图1所示)。单链miRNA首先结合核糖核蛋白形成miRISC复合体，miRISC复合体通过结合的miRNA与靶基因mRNA碱基互补，介导该靶基因的切割或者翻译抑制。miRISC免疫沉淀法使用RISC核糖核蛋白的抗体或表位标记物通过免疫沉淀(IP)把RNA-蛋白复合物一起分离出来，然后对结合在复合物上的RNA(包含miRNA及其靶基因mRNA)进行分析[23]。RNA分析方法包括cDNA克隆[24, 25]、基因芯片(IP-Chip)[26, 27]和 近来出现的高通量深度测序(IP-Seq)[28, 29]等。

图1 miRNA靶基因筛选与鉴定方法

AGO蛋白家族成员是RISC蛋白必需组分。研究表明，和真核起始因子eIF4E一样，AGO蛋白也能特异性地结合mRNA 5’端的m7G帽子结构。AGO蛋白结合miRNA后，在miRNA介导下和靶基因mRNA的m7G帽子结合，阻止了eIF4E和mRNA帽子结构结合，导致mRNA翻译受到抑制[30-32]。因此AGO蛋白能同时和miRNA及其靶基因mRNA结合，另外 miRNA和mRNA之间也存在碱基互补结合，这些结合力共同作用保证AGO蛋白能形成稳定的miRNP复合体，可以耐受免疫共沉淀的试验条件而不分离。这样通过直接免疫沉淀AGO蛋白就能把结合的miRNA和靶基因mRNA一起沉淀下来。为了提高miRISC/miRNP复合体的稳定性，后来又通过紫外交联的方法加强了RNA和蛋白的结合，可直接获得miRNA和靶mRNA的结合位点，大大提高了miRISC/miRNP免疫沉淀法的可靠性和灵敏性[28, 29]。

miRISC免疫沉淀法是现今技术最成熟的方法，其一出现就被广泛应用于miRNA靶基因的规模化鉴定[24-29, 33-47]。miRISC免疫沉淀一般采用AGO抗体免疫沉淀天然AGO蛋白，或者先将AGO蛋白和外源标签融合表达(主要为FLAG、HA和HIS等)，然后用抗标签蛋白的单抗免疫沉淀表达的标签-AGO融合蛋白。该方法在2007年首先得到利用，Beitzinger等分别使用AGO1和AGO2蛋白的单抗在人类细胞中进行免疫沉淀，得到与AGO1和AGO2蛋白结合的mRNA各600条，随机挑选6条进行双荧光素酶报告基因检测，发现其中有5条都是miRNA的靶基因[24]。Karginov等在人293s细胞中分别表达c-myc-Ago1和c-myc-Ago2融合蛋白，用抗c-myc抗体免疫沉淀，通过基因芯片分析证实了共沉淀获得的RISC复合物中存在miRNA和相应靶基因mRNA。进一步在293s细胞中通过载体表达自身没有的miR-124a，免疫沉淀miRNP/RISC复合物中miR-124a靶基因mRNA富集和对照相比高达7.6～38倍不等。经验证从富集的63个基因中挑选的4个基因全部都是miRNA的靶基因[27]。Easow等利用HA抗体免疫沉淀果蝇S2细胞中表达的HA融合AGO1蛋白，基因芯片分析了miRNP结合的mRNA后发现，大量计算机预测的miRNA靶基因得到了富集；为了分析单个miRNA的靶基因，同时分析了瞬时表达miR-1细胞中miRNP结合的mRNA，发现预测的miR-1靶基因富集达到了3倍，进一步对野生型果蝇和miR-1缺失果蝇的miRNP结合mRNA进行了分析，得到32个存在miR-1结合位点的靶基因，选择其中11个结合位点碱基数为7(miR-1的2-8位)的靶基因进行实验验证，证实全部为miR-1靶基因[26]，为miRNA靶基因的寻找提供了新的思路。 EIF2C2为AGO家族的一个成员，Landthaler 等在HEK293细胞中表达HA-EIF2C2，同时表达该细胞系中没有的miR-122，抗HA IP使得miRNA和靶基因同时得到富集，同时证实免疫共沉淀miRNP方法不仅能获得内源miRNA靶基因，同时也能获得外源表达的miRNA靶基因mRNA；外源表达miR-122富集最高的16个靶基因，有14个通过实验验证，表明可以通过特异性表达miRNA来获得该miRNA靶基因[33]。另一个研究组在HEK239中表达了FLAG-AGO2，芯片检测表明，抗FLAG免疫沉淀中的富集mRNA达1215个；同时证明，过表达AGO对细胞的内源mRNA和miRNA表达影响很小[34]。

AGO蛋白和靶基因mRNA结合的牢固程度和miRISC免疫共沉淀结果好坏直接相关。Hausser等研究表明，AGO蛋白和mRNA结合的牢固程度和mRNA三级结构有关[35]。影响mRNA三级结构因素包括其所处不同的环境，Hong等研究了不同抗体浓度，孵育时间和洗脱条件对AGO免疫共沉淀所获得mRNA的影响，最后优化实验条件后提高了共沉淀方法的灵敏度；和未上调miRNA的对照细胞相比，上调miRNA细胞中AGO IP组分中共有1621个 mRNA的富集具有显著性差异，其中1191个基因富集倍数大于1.4，464个基因富集倍数大于2，89个基因富集倍数大于4[36]，获得富集靶基因数目大大提高。Chi等开发的HITS-CLIP方法通过紫外照射使AGO蛋白和miRNA与靶基因mRNA产生交联，使得RISC复合体中RNA-蛋白结合更加稳定，形成类似于三聚体的复合物，结合高通量测序技术能获得全基因组范围的miRNA靶基因信息[28]。

另外，为了获得特定miRNA的靶基因，一般在细胞中上调或下调特定miRNA，然后用基因芯片检测免疫沉淀组分中mRNA富集倍数的变化来获得特定miRNA靶基因[24-27, 33-37]。为了进一步提高特定miRNA靶基因的鉴定可靠性和灵敏性，Nonne等开发了TAP-Tar方法，该方法将待研究miRNA进行生物素标记，然后转染到细胞中，依次通过GST pull down和生物素pull down获得AGO复合物中和目标miRNA结合的潜在靶基因mRNA，通过两次串联筛选，所获得mRNA为特定miRNA靶基因的可靠性大大提高[38]。Mohammad[25]和Zhao[39]课题组分别采用miRNA种子区序列为引物，对AGO共沉淀组分中特定miRNA靶基因进行PCR扩增，获得特定miRNA靶基因的可靠性和灵敏度也大大提高。

上述方法虽然能够得到miRNA靶基因，但不能直接获得miRNA结合位点信息，miRNA结合位点只能通过生物信息学预测后通过实验验证。IP方法到底倾向于捕获什么类型的靶位点？Chi等开发的HITS-CLIP方法通过免疫共沉淀分离紫外照射后的AGO蛋白与结合RNA复合物，然后用核酸酶处理，靶基因mRNA的AGO非结合区由于没有AGO蛋白的保护被切除，通过深度测序获得剩下的mRNA 与miRNA结合片段及AGO结合的miRNA序列，进一步采用生物信息学方法获得了miRNA全基因组范围内的靶基因结合图谱[28]。同样，Zisoulis等采用CLIP-seq方法[29]，通过紫外交联线虫，用抗ALG-1抗体免疫沉淀获得稳定结合AGO的miRNA和mRNA，然后同样用核酸酶处理，剩下mRNA的miRNA结合片段。该方法从全基因组范围鉴定了4860个野生型线虫所特有miRNA结合位点，这些位点分别位于3093个基因中，占线虫已注释基因的20%。这些miRNA结合位点序列中种子序列大小在6～8 nt之间，说明IP方法倾向于捕获结合位点种子序列在6～8 nt的靶位点。采用相似的方法，Hafner等[40, 41]应用PAR-CLIP方法，通过紫外交联HEK293细胞与AGO免疫沉淀，高通量测序获得将近20000个富集的序列片段，90%片段能够和高表达miRNA的种子序列匹配。上述方法只能分别获得AGO结合miRNA和靶基因结合位点序列，然后需借助生物信息学方法匹配miRNA及其相应的结合位点，可能出现一定的错误，不能直接获得miRNA及其相应靶基因结合位点序列。Helwak等采用CLASH方法将紫外交联后的RISC复合物用核酸酶酶切，酶切产物中受AGO蛋白保护的miRNA及其靶基因结合片段用RNA连接酶连接后直接通过高通量测序，获得miRNA及其相应靶基因结合位点序列。该方法共获得18514个miRNA-mRNA结合对，代表399个miRNA及其对应的6959个靶基因[46]。上述结果表明，结合紫外交联与高通量测序技术，我们可以在基因组范围内鉴定miRNA靶基因的结合位点，大大提高了解析miRNA靶基因的能力[47]。

3 小结

miRNA靶基因的高通量鉴定与筛选对miRNA的功能解析起至关重要的作用。由于miRNA和靶基因的作用位点并不完全匹配，没有明显的规律可寻，导致应用传统方法鉴定与筛选靶基因十分困难。因此，开发高通量特异的，灵敏度高的miRNA靶基因筛选与鉴定方法对miRNA功能研究变得十分重要。

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