超声波法提取板栗壳多糖的 工艺条件优化

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(1.湖北大学知行学院,生物工程系,湖北武汉 430010;2.昆明理工大学分析测试中心,云南昆明 650093;3.清远职业技术学院,广东清远 511510)

板栗俗称栗子,有“干果之王”的美称[1]。栗壳为板栗的外果皮,药性甘、涩、平,具有降逆、止血的功效,主治反胃、鼻衄、便血等症[2]。正因为板栗的食用以及药用价值,所以板栗各部分的研究引起了学者们的兴趣。

大量的药理和临床研究发现,从天然产物中分离出来的多糖往往是一种免疫调节剂,它能激活免疫细胞而对正常细胞没有毒副作用。多糖作为免疫治疗药物正越来越受到重视,已成为新药研究的热点之一。越来越多的研究证明,多糖不但能治疗导致机体免疫系统受到严重损伤的癌症,又能治疗多种免疫缺损疾病,如慢性病毒性肝炎和某些耐药细菌或病毒引起的慢性疾病[3-5],而且多糖作为药物对细胞毒性小,在治疗肿瘤时,它不像化疗药物直接杀死生长着的癌细胞,而是作为一种生物免疫反应或加强抗体生成及激活剂补体等,以达到抑制和消灭肿瘤细胞的效果,对正常细胞影响极小[6]。多糖对多种恶性肿瘤、心血管疾病和抗衰老都有一定疗效。近年来的研究表明糖结合物在信息传递、分子识别过程中具有关键作用[7]。

目前,国内对于板栗多糖的研究还处在起步阶段,相关报道不是很多,多集中在板栗多糖的提取工艺优化、成分及活性研究[4,8-9]。很少有对于板栗壳中多糖的研究。本文以板栗壳为原料,利用超声波辅助提取板栗壳中多糖物质,采用中心实验设计优化板栗壳多糖超声辅助提取工艺参数,为后续实验和实际生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

板栗 湖北罗田;无水乙醚、过氧化氢、三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇、葡萄糖、蒽酮、乙酸乙酯、浓硫酸、丙酮 均为分析纯。

电热恒温鼓风干燥箱DHG-9075A型 上海一恒科学仪器有限公司;高速万能粉碎机FW80型 天津市泰斯特仪器有限公司;数显恒温水浴锅HH-2型 国华电器有限公司;循环水式多用真空泵SHB-Ⅲ型 郑州长城科工贸有限公司;超声波细胞粉碎机JY88-II型 宁波新芝生物科技股份有限公司;紫外-可见分光光度计WFJ-7200型 上海尤尼柯仪器有限公司;电子分析天平AR1140型 奥豪斯国际贸易(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 参考文献[9-14]的方法。

研磨成粉→乙醚去脂→乙醇浸提→脱色→干燥

取新鲜罗田板栗,剥壳、干燥、磨粉(40目),按1∶3(m/v)的比例分别加入乙醚和乙醇进行脱脂与除单糖和寡糖并用双氧水脱色。精确称取2g经过上述处理的板栗壳粉2.0g于锥形瓶中,向锥形瓶加入蒸馏水放入超声波仪器中,按设定条件(提取时间、超声波功率、料液比)进行超声波提取,提取后的混合液用真空泵抽滤并移入分液漏斗中分离滤液,在滤液中加入三氯甲烷-正丁醇的混合液10mL,剧烈振荡20min使其充分混匀,利用分液漏斗提取上清液,分离出三氯甲烷层,除去蛋白质[13]。将上清液取5.0mL移入50mL容量瓶中定容,用于测定糖含量。

1.2.2 葡萄糖标准曲线的绘制 分别吸取葡萄糖标准溶液(200mg/L)0、2、4、6、8、10mL依次置于6个试管中,再分别加入去离子水至1.0mL[15],摇匀后分别加入新配制的0.2%蒽酮乙酸乙酯溶液0.5mL和浓硫酸5.0mL摇匀[16],补齐至10mL后置于沸水中水浴10min,以空白溶液作参比,分别于620nm处测定吸光值(A)。以多糖质量为横坐标,以吸光度为纵坐标,作标准曲线。以吸光度(A)对葡萄糖浓度(C)进行回归分析,并得回归方程。

计算公式:多糖得率(%)=CX/M×100

式中:C为糖质量浓度(mg/mL);X为稀释倍数;M为提取所用板栗壳粉的质量(g)。

1.2.3 板栗壳多糖提取的单因素实验 影响板栗壳多糖提取的因素有很多,本实验分别考察超声波功率、超声波工作时间以及料液比三个因素进行单因素实验。具体做法如下[1,8,11]:

分别采取功率100、125、150、175、200W,在料液比1∶90、提取时间20min条件下提取板栗壳中的多糖,提取液于620nm处测定吸光值(A),考察超声波功率对板栗壳多糖提取的影响;

分别采取超声波处理时间10、15、20、25、30min,在料液比1∶90,功率150W条件下提取板栗壳多糖,提取液于620nm处测定吸光值(A)。考察超声波处理时间对板栗壳多糖提取的影响;

分别采取料液比为1∶30、1∶50、1∶70、1∶90、1∶110,在超声波功率150W,超声波工作时间为25min的条件下提取板栗壳多糖,提取液于620nm处测定吸光值(A)。考察料液比对板栗壳多糖得率的影响。

1.2.4 板栗壳多糖提取工艺的响应曲面法优化 分别以超声波作用时间、功率和料液比3个因素为自变量,板栗壳多糖的得率为响应值,在单因素实验的基础上,选取单因素实验中三个自变量的优水平作为零水平,根据响应面中心组合实验设计原理设计三因素三水平的优化实验。实验因素与水平设计见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Factors and levels in the response surface design

1.2.5 验证实验 根据Design Expert软件对响应面优化实验的结果进行分析,预测板栗壳多糖提取的最优工艺组合。在此基础上,根据软件分析给出的最优工艺组合条件进行验证实验以确定其可靠性。

1.2.6 数据处理 单因素实验使用Microsoft Excel 2007软件进行分析,响应曲面实验使用Design Expert软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制及测定

以多糖质量为横坐标,以吸光度为纵坐标,作标准曲线如图1所示。以吸光度(A)对葡萄糖浓度(C)进行回归分析,并得回归方程。A=2.9991C,R2=0.9973。

图1 葡萄糖标准曲线 Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 单因素实验

2.2.1 超声波功率对板栗壳多糖得率的影响 超声波功率对板栗壳多糖得率影响如图2所示。

由图2可以看出,超声波功率在100W到150W区间内,板栗壳多糖得率快速上升,在150W到175W内的阶段逐渐下降,在175W到200W内平缓上升。当超声波功率为150W的时候,多糖得率最高,故最佳值取150W。

2.2.2 超声波处理时间对板栗壳多糖得率的影响 超声波处理时间对板栗壳多糖得率影响如图3所示。

图2 超声波功率对多糖得率的影响 Fig.2 The effect of ultrasonic power on the rate of extraction of polysaccharide

图3 超声波处理时间对多糖得率的影响 Fig.3 The effect of time on the rate of extraction of polysaccharide

由图3可以看出,当超声波作用时间在10～20min时,多糖得率呈现明显上升趋势,而后趋于平缓。当作用时间超过25min后基本变化不大。因此,当超声波作用时间超过25min能得到较高的吸光度值,考虑到成本和设备使用情况,因此取25min为最佳值。

2.2.3 料液比对板栗壳多糖得率的影响 实验结果如图4所示。

图4 料液比对多糖得率的影响 Fig.4 The effect of material-liquid ratio on the rate of extraction of polysaccharide

由图4可以看出,当料液比小于1∶70时多糖的得率是逐渐增大的,而当料液比大于1∶90之后,其多糖的提取率呈降低趋势,根据图4所反映的情况本次实验以1∶70为最佳值用于后续响应面分析。

2.3 响应面实验

2.3.1 响应面分析方案与实验结果 根据单因素实验结果,确定响应面曲面实验中的超声波功率(A)、作用时间(B)、料液比(C)三个因素,根据Central composite中心组合实验原理,进行响应面分析实验。实验结果如表2所示。

表2 响应面分析方案与实验结果Table 2 Factors and levels in the response surface central composite design arrangement and corresponding experimental results

经过Design Expert软件对板栗壳多糖的得率与不同操作参数之间建立多种拟合模型,通过多种拟合模型比较发现二次方程模型的拟合效果较其他模型好。以板栗壳多糖得率为响应值进行回归,建立二次回归模型,得到板栗壳多糖得率预测值对编码自变量A、B、C的二次多项回归方程:

Y=11.41+0.18A+0.13B-0.29C+0.18AB+0.20AC-0.05BC-0.8A2-1.06B2-1.24C2

为了检验模型的有效,对模型进行方差分析。由表3可知,模型是显著,回归模型的p<0.01(极显著),说明该模型能够很好地描述实验结果。因此,可用此模型对板栗壳多糖提取效果进行分析和预测。同时从表3的数据分析可以看出A、B、C一次项均不显著。二次项A2、B2、C2为实验极显著影响因素。交互项AB、AC、BC不显著。说明在此模型当中,A、B、C因素的一阶以及交互作用并不显著。在三个因素之间相比较而言,料液比对板栗壳多糖提取效果影响最大,其次是超声波功率,处理时间对板栗壳多糖提取效果影响相对较小。

表3 回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance for each term of the fitted regression model

2.3.2 响应曲面分析 超声波提取功率与处理时间的交互作用响应曲面见图5。由图5可看出,在料液比为1∶70的条件下,超声波提取功率与作用时间的交互作用不显著(p=0.4511>0.05)。随着超声波提取功率和作用时间的增大,响应面的响应值是平缓的先上升后下降,说明响应值对于超声波提取功率的改变不敏感。

图5 超声波功率与作用时间交互作用的响应曲面 Fig.5 The interactive response surface plots between ultrasonic power and time

超声波提取功率与料液比交互作用的响应曲面见图6。由图6可以看出,在作用时间为25min时,超声波提取功率与料液比交互作用不显著(p=0.4155>0.05)。随着超声波提取功率的增大,响应面的响应值平缓的先升高后降低;随着料液比的增大响应面的响应值先上升后下降。

图6 超声波提取功率与料液比交互作用响应曲面 Fig.6 The interactive response surface plots between ultrasonic power and liquid ratio

作用时间与料液比交互作用响应面见图7。由图7可以看出,在超声波提取功率为150W时,作用时间与料液比对响应值的交互作用不显著(p=0.8320>0.05)。随着料液比的增加,响应面的响应值先升高后降低;随着的作用时间的增长,响应面的响应值先升高后缓慢的下降。

图7 作用时间与料液比交互作用响应面 Fig.7 The interactive response surface plots between time and liquid ratio

2.3.3 最佳工艺条件确定及验证 通过软件分析得响应面法优化板栗壳多糖提取的最佳工艺条件:超声波提取功率为165W,作用时间26.875min(取27min),料液比为1∶62.3(取1∶62)。按照选择的最佳工艺进行实验来验证是否符合模型方程式预测的最佳响应值,实验测得多糖得率为11.48%,与预测值11.4358%较接近,说明优化的得到的最佳工艺条件与实际情况拟合好,验证了建立的模型的正确性。

3 结论

本文以板栗壳为研究对象,在单因素实验的基础上,应用响应曲面设计法优化进行工艺优化,得出超声波提取板栗壳多糖工艺条件:超声波功率为165W,处理时间为27min,料液比为1∶62。优化后超声波提取板栗壳多糖的得率为11.48%。这三个因素对于板栗壳多糖提取工艺影响的顺序为:料液比>超声波功率>处理时间。经验证实验证明优化效果较好,证明该数学模型是合理可靠的,对板栗壳多糖的提取工艺可行。

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