发酵条件对梨醋酿造过程中有机酸的影响

2014-03-22,,

食品工业科技 2014年3期

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(1.河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050018;2.河北省农林科学院遗传生理研究所,河北石家庄 050051)

果醋是以水果为主要原料,经酒精、醋酸两个阶段发酵酿制而成的营养丰富、风味独特的酸性保健饮品[1-2]。果醋的酸味决定于其有机酸的构成和含量,而有机酸的构成和含量决定了果醋的酸感与风味特点,进而影响果醋的感官品质。苹果酸酸味爽快柔和、刺激性缓慢、保留时间较长;柠檬酸酸味爽口,其酸度比苹果酸高,人的味觉更易感知;奎宁酸和莽草酸则可产生苦味[3];醋酸具有较强的刺激性,而柠檬酸、苹果酸、琥珀酸可缓冲醋酸的刺激性,使酸味柔和、醇厚[4-5]。这些有机酸共同决定了果醋的酸感。梨汁本身含有苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、奎宁酸、莽草酸、乳酸等多种有机酸[6-7]。酿酒酵母在酒精发酵过程中不仅会将糖转化为酒精,而且在其生长代谢过程还会产生苹果酸和琥珀酸等有机酸[8]。醋酸菌在苹果醋醋酸发酵过程中代谢消耗苹果酸、乳酸、琥珀酸,而产生和积累柠檬酸[9]。国内对梨醋的酿造工艺进行了许多研究,然而,有关梨醋酿造过程中有机酸变化的研究却报道很少。本文以河北特产鸭梨为原料酿制成梨醋,采用反相高效液相色谱(HPLC),分析研究了酒精发酵阶段和醋酸发酵阶段发酵条件对梨酒和梨醋有机酸的影响,以期为梨醋酿造的工艺优化及酸感质量评价提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸭梨河北省赵县产;安琪酿酒酵母(约220亿个/g) 湖北安琪酵母股份有限公司;酿酒酵母1416、33133、1253、31009 中国工业微生物菌种保藏中心;沪酿1.01醋酸菌石家庄珍极酿造集团;巴氏醋酸菌中国工业微生物菌种保藏中心;醋酸菌SG19、SG20 本实验室自筛;草酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸天津市风船化学试剂科技有限公司,分析纯;酒石酸天津市博迪化工有限公司,分析纯;奎宁酸、琥珀酸、莽草酸上海源叶生物科技公司,分析纯。

JYZ-E6螺杆式榨汁机九阳股份有限公司;SPX-250B-II型生化培养箱上海贺德实验设备厂;LG16-B型高速离心机北京雷勃尔设备有限公司;LC-20AT液相色谱仪,配有紫外检测器、在线脱气机和色谱柱恒温箱岛津企业管理(中国)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 梨汁的制备选择新鲜无病的成熟鸭梨,清水洗净、去核后,用螺杆式榨汁机榨汁。采用阿贝折光仪测得梨汁的糖度为11.2%。

1.2.2 酒精发酵

1.2.2.1 安琪酿酒酵母的活化配制5%的葡萄糖水,以100∶1(v/w)比例加入安琪干酵母,35℃活化40min。

1.2.2.2 酿酒酵母种子培养基 2%葡萄糖,0.5%酵母粉,0.3%蛋白胨,0.2% KH2PO4,0.2%(NH4)2SO4,pH 5.0。

1.2.2.3 酿酒酵母种子液的制备在100mL酿酒酵母菌种子培养基中,分别接入2～3环斜面保藏的酿酒酵母1416、33133、1253、31009,30℃、180r/min 摇床培养2d。

1.2.2.4 酒精发酵将150mL梨汁加入250mL的三角瓶中,并按10%接种量接入酿酒酵母种子液,用8层干净的纱布封口,在生化培养箱静置进行酒精发酵,并采用阿贝折光仪监测发酵液糖度。当糖度不再明显降低,终止酒精发酵。

1.2.3 醋酸发酵

1.2.3.1 醋酸菌种子培养基 5%(v/v)无水乙醇、1%葡萄糖、1%酵母粉、0.2%(NH4)2SO4、0.2% KH2PO4、0.2% MgSO4。

1.2.3.2 醋酸菌种子液的制备将2～3环斜面保藏的沪酿1.01、巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和SG20,分别接种到100mL醋酸种子培养基中,30℃、180r/min 摇床培养2d。

1.2.3.3 醋酸发酵酒精发酵结束后,5000r/min离心10min除去酵母菌体和果肉残渣。按10%接种量接入醋酸菌种子液进行静置醋酸发酵,并采用酸碱滴定法监测发酵液的酸度。直到酸度不再明显升高,终止醋酸发酵。

1.2.4 酿酒酵母种类对梨酒有机酸的影响在150mL梨汁中,按10%接种量分别接入安琪酵母、酿酒酵母1416、33133、1253、31009种子液,28℃下静置进行酒精发酵。

1.2.5 发酵温度对梨酒有机酸的影响按10%接种量向150mL梨汁中接入酿酒酵母1416种子液,分别在25、28、30、34℃下进行静置酒精发酵。

1.2.6 醋酸菌种类对梨醋有机酸的影响 150mL梨汁中,按10%接入酿酒酵母1416种子液,28℃静置发酵3d。酒精发酵结束后,5000r/min离心10min,制得澄清梨酒(酒精含量3.86%)。在120mL梨酒中按8%接种量分别接入沪酿1.01、巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和醋酸菌SG20种子液,30℃下进行表面静置醋酸发酵。

1.2.7 醋酸发酵温度对梨醋有机酸的影响在120mL梨酒中按8%接种量接入沪酿1.01醋酸菌种子液,分别在25、30、34、37℃下进行表面静置醋酸发酵。

1.2.8 醋酸发酵方式对梨醋有机酸的影响在120mL梨酒中按8%接种量接入沪酿1.01醋酸菌种子液,在30℃下分别进行表面静置醋酸发酵(10d)和摇床深层醋酸发酵(120r/min、8d)。

1.3 有机酸的测定

1.3.1 色谱条件色谱柱:Inertsil ODS-SP C18色谱柱(4.6mm×250mm);流动相:0.01mol/L KH2PO4溶液,pH2.55(用50%的H3PO4调节);流速:0.50mL/min;柱温:30℃;检测波长:210nm;进样量:20μL/次。

1.3.2 标准溶液的配制分别准确(精确至0.0001g)称取0.2g草酸、1.0g酒石酸、5.0g苹果酸、1.0g莽草酸、5.0g乳酸、6.0g乙酸、3.0g柠檬酸、8.0g琥珀酸、0.1g奎宁酸,用三蒸水溶解并定容至100mL,制备得到有机酸的标准储备液。上述溶液配制成不同浓度的混合标准液,用0.22μm滤膜过滤后,上机绘制9种有机酸的标准曲线。

1.3.3 样品预处理取5mL梨酒或梨醋,8000r/min离心10min,得到上清液。用三蒸水稀释合适倍数后经0.22μm膜滤后进行HPLC测定。

1.3.4 有机酸定性定量方法样品以保留时间和各有机酸紫外吸收光谱来定性,以峰面积外标法定量。每个样品重复3次,取其平均值。

2 结果与分析

2.1 鸭梨汁中的有机酸

为了研究鸭梨醋酿造过程中有机酸的变化,采用HPLC测定了鸭梨汁中9种有机酸,分析结果见表1。鸭梨汁中含有丰富的有机酸,其中含量最高的为苹果酸,占总酸含量的52.2%;其次为草酸和奎宁酸,分别占总酸含量的18.6%和10.9%;而柠檬酸含量较少。高海燕等人[7]也测定了河北鸭梨汁中的有机酸,发现鸭梨汁中主要有机酸含量依次为:苹果酸﹥柠檬酸﹥奎宁酸,这与本实验的结果不完全一致,造成这种差异的原因是由于土壤、栽培管理、果实成熟度等条件的不同。

2.2 酒精发酵阶段发酵条件对梨酒中的有机酸的影响

2.2.1 酿酒酵母种类对梨酒有机酸的影响为了考察酿酒酵母种类对梨酒中有机酸的影响,本实验使用了安琪酵母、酿酒酵母1416、33133、1253、31009酿酒酵母来酿制梨酒,并测定了其中9种有机酸的含量,分析结果见表2。

表1 鸭梨汁中有机酸的含量(mg/100mL)Table 1 The contents of organic acids in Ya’ pear juice(mg/100mL)

表2 不同酿酒酵母酿制梨酒中有机酸的含量(mg/100mL)Table 2 The contents of organic acids in perry fermented with different yeasts(mg/100mL)

由表2可见,同发酵前(鸭梨汁)相比,梨酒中的草酸、奎宁酸含量均表现为下降,乳酸、琥珀酸含量则均表现为上升,这表明5种酿酒酵母在酒精发酵过程中,代谢消耗了部分草酸和奎宁酸,同时产生乳酸和琥珀酸。在葡萄酒的酒精发酵过程中,酵母菌也会产生乳酸和琥珀酸[10]。其它5种有机酸变化因酿酒酵母种类的不同而有很大差别。例如,酿酒酵母1416、31009和安琪酿酒酵母均产生大量的乙酸,而酿酒酵母1253却不产生乙酸;酿酒酵母31009会大量利用消耗苹果酸,而酿酒酵母1253却可少量合成苹果酸。在葡萄酒酿造过程中,也发现苹果酸既可被酵母代谢,又可被合成[11]。由于使用的酿酒酵母的不同,造成所酿制的梨酒中主要有机酸(含量>100mg/100mL)种类也不同。例如,酿酒酵母1253酿制梨酒的主要有机酸为苹果酸,与鸭梨汁的相同,而酿酒酵母31009酿制梨酒的主要有机酸为乙酸。

从表2还可见,仅有酿酒酵母1416使得酒精发酵后的有机酸总量显著增加,造成这种现象的主要原因是酿酒酵母1416大量产生乙酸,达到了363.74mg/100mL;安琪酿酒酵母、酿酒酵母1253、酿酒酵母31009却使得梨酒中的有机酸显著减少,其原因是草酸、奎宁酸、莽草酸及苹果酸(酿酒酵母1253例外)大幅度减少;对于酿酒酵母33133而言,梨酒中的有机酸总量几乎保持不变,而这种不变实际是几种有机酸涨消平衡的结果。由此可见,酿酒酵母的种类对梨酒中有机酸含量有着很大的影响。选择使用酸感良好的酿酒酵母,对于获得风味优良的高品质梨醋是非常重要的。在酒精发酵过程中,酿酒酵母1416在产生酒精的同时还产生较多的有机酸,而且其中主要是乙酸(56.0%)和苹果酸(18.2%)。故从梨醋生产的角度考虑,1416为较适宜的酿酒酵母。

2.2.2 发酵温度对梨酒有机酸的影响发酵温度是影响酿酒酵母生长和产生酒精的重要影响因素之一。酒精发酵温度对梨酒中9种有机酸的影响分别见图1和图2。

图1 酒精发酵温度对梨酒有机酸的影响 Fig.1 Effect of ethanol fermentation temperature on organic acids in perry

图2 酒精发酵温度对梨酒有机酸的影响 Fig.2 Effect of ethanol fermentation temperature on organic acids in perry

如图1、图2所示,梨酒中乙酸、琥珀酸随着酒精发酵温度的升高而增加,尤其是乙酸,当发酵温度从25℃升高到34℃时,乙酸含量从70.13mg/100mL增加到482.0mg/100mL,增加了5倍多;而苹果酸、乳酸、奎宁酸含量则随着酒精发酵温度的增加而降低。苹果酸含量的降低是由于部分苹果酸转化成了琥珀酸[10]。酒石酸、柠檬酸含量分别在28、30℃下达到最高值,随着温度的进一步增加,其含量降低。发酵温度对梨酒的莽草酸、草酸含量影响很小。在实验中发现,当发酵温度为34℃时,梨酒在12h之内出现浑浊现象,发酵结束后的风味明显不如低温的。造成这一现象的原因,可能是因为30℃以上的高温发酵容易使酵母生长繁殖过快,过多的消耗了梨汁的营养成分,导致梨酒果香味淡薄[12]。上述结果表明,酒精发酵温度对梨酒中有机酸的代谢和合成有着显著影响,因此,在选择酒精发酵温度时,不仅要考虑发酵温度对酒精发酵效率的影响,还要考虑对有机酸变化以及由此产生的对梨酒风味的影响。从梨酒风味角度考虑,28℃为适宜酒精发酵温度。

2.3 醋酸发酵阶段发酵条件对梨酒中的有机酸的影响

2.3.1 醋酸菌种类对梨醋有机酸的影响在梨酒中分别接种沪酿1.01、巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和SG20,30℃下进行表面静置醋酸发酵,实验结果见表3。

表3 不同醋酸菌酿造梨醋中有机酸的含量(mg/100mL)Table 3 The contents of organic acids in pear vinegar fermented with different acetic acid bacteria(mg/100mL)

如表3所示,4种醋酸菌均大量产生乙酸,乙酸含量占总酸比例均达到80%以上,特别是沪酿1.01氧化乙醇产生乙酸能力很强,其产酸量比其它3个菌种高一倍以上,这是由于沪酿1.01是一个米醋工业生产上使用的菌种。与梨酒中的有机酸相比,4种醋酸菌均使得梨醋中酒石酸含量增加,而使得柠檬酸含量降低,说明4种醋酸菌均有代谢酒石酸和柠檬酸的能力,醋酸发酵过程中消耗柠檬酸,而产生和积累酒石酸。除乙酸、酒石酸和柠檬酸外,梨醋中的有机酸变化因使用的醋酸菌而异。例如,巴氏醋酸菌、醋酸菌SG19和醋酸菌SG20在醋酸发酵期间显著地消耗了部分苹果酸,而沪酿1.01醋酸菌却产生一些苹果酸;沪酿1.01、巴氏醋酸菌和醋酸菌SG20可产生部分奎宁酸,而醋酸菌SG19却将梨酒中奎宁酸代谢殆尽。梨醋中主要有机酸也因使用的醋酸菌而异,例如,沪酿1.01梨醋的主要有机酸依次为:乙酸>苹果酸>奎宁酸>酒石酸,而巴氏醋酸菌梨醋主要有机酸依次为:乙酸>酒石酸>苹果酸>奎宁酸。醋酸发酵结束后,沪酿1.01发酵液总酸达到2348.4mg/100mL,有明显的醋酸味,而其它3种醋酸菌发酵液由于总酸较少,醋酸味较淡,梨醋的品质较差。由上述可知,醋酸菌的种类对梨醋中有机酸的代谢有显著影响。

2.3.2 醋酸发酵温度对梨醋有机酸的影响为了了解发酵温度对梨醋酿制过程中有机酸产生的影响,在梨酒中接种沪酿1.01醋酸菌,分别在25、30、34、37℃下进行表面静置醋酸发酵,实验结果见图3和图4。

图3 醋酸发酵温度对梨醋有机酸的影响 Fig.3 Effect of acetic fermentation temperature on organic acids in pear vinegar

图4 醋酸发酵温度对梨醋有机酸的影响 Fig.4 Effect of acetic fermentation temperature on organic acids in pear vinegar

作为梨醋中最主要的有机酸,乙酸含量在25～34℃范围内随着发酵温度的上升而增加;当发酵温度超过34℃时,梨醋乙酸含量明显下降,这是由于醋酸发酵温度过高时菌体老化加快,产酸量降低[13]。酒石酸、奎宁酸、莽草酸、琥珀酸和乳酸含量随着发酵温度的升高而增加,但增幅不一。在较低(25℃)或较高(37℃)发酵温度下有利于柠檬酸的产生。苹果酸和草酸的含量受发酵温度影响很小。

2.3.3 醋酸发酵方式对梨醋有机酸的影响将沪酿1.01醋酸菌接种在梨酒中,分别进行表面静置醋酸发酵和摇床深层醋酸发酵,实验结果见表4。从表4中可发现,摇床深层发酵酿制梨醋的总酸要高于表面静置发酵,其有机酸含量差别及对梨醋酸感的影响主要体现在乙酸和苹果酸上。摇床深层发酵产生的乙酸显著高于表面静置发酵,其原因是醋酸发酵是一个好氧发酵过程,摇床深层发酵可提供比表面静置发酵更多的氧气,而较充足的氧气供给更有利于乙醇的转化。从表4中还可发现,表面静置发酵会使得沪酿1.01合成部分苹果酸,与之相反,摇床深层发酵却会造成大量苹果酸的消耗;苹果酸酸味爽快柔和,这可能是导致静置发酵梨醋风味好于摇床发酵的原因之一。陈义伦等[9]研究了醋酸发酵方式对苹果醋中有机酸的影响,发现静置发酵酿制苹果醋中苹果酸仅略高于摇床发酵,且发酵方式对酸种类和含量影响不大,与本研究的结果不太一致,其原因可能是由于所使用的酿造原料及醋酸菌的不同。