结直肠癌肝转移相关的分子标志物

陈婧，何友吉

(东南大学医学院 微生物与免疫学系，江苏 南京 210009)

结直肠癌已发展成为中国第五大癌症杀手[1]，远处转移是结直肠癌患者的主要死因，40%～50%的患者在原发灶切除后发生肝转移。不可手术的肝转移患者尽管有靶向药物的使用，其中位生存期仍不超过2年。因此，尽早发现肝转移对于判断结直肠癌患者的预后以及是否需要采取干预措施至关重要。

肿瘤细胞的浸润和转移是一个复杂的过程。肿瘤转移的“宿命论”认为，决定肿瘤生物学行为及临床表型的遗传学改变在原发肿瘤中已经存在[2]，该学说已被Van’t Veer等用芯片技术在乳腺癌的原发灶中证实[3]。

在结直肠癌的研究中发现，肝转移灶中的DNA拷贝数谱及基因表达谱与其原发灶高度相似，与上述“宿命”模型一致[4- 5]，表明从结直肠癌的原发灶出发能够找出预测其肝转移的生物学指标。在对结直肠癌组织和细胞株展开的大量分子和细胞遗传学研究中发现，结直肠癌的发展有明确的病理阶段，每个阶段有特异的癌/抑癌基因的突变[6]。这些改变发生的关键机制是基因组的不稳定，可归纳为两种方式：由DNA错配修复缺陷导致的微卫星不稳定(microsatellite instability， MIN or MSI)，仅占15%，其肿瘤细胞通常保持正常的二倍体状态；另一种则是在染色体水平上呈现的基因组不稳定性，即由于染色体不稳定(chromosomal instable，CIN)而产生非整倍体(aneuploidy)的变化，占85%。

本文中作者对目前正在从染色体、基因、蛋白等各水平寻找与结直肠癌肝转移相关分子标志物的文献进行综述。

1 与结直肠癌肝转移相关的染色体变异

基于现有aCGH(array comparative genomic hybridization)和SNP(single nucleotide polymorphism)的研究，结直肠癌中常被报道的染色体改变包括7， 8q， 13q 和20q的扩增及4， 8p，14q， 15q， 17p 和18q的缺失[7- 9]，现已证实DNA拷贝数的变化发生在特定模式下，并与不同的临床表现相关[10- 12]。

目前SNP芯片的分辨率已经能够检测到染色体上小于2.5kb有变异的区域，Sayagues J.M等用高分辨率的SNP(500K)检测了23例肝转移患者的原发灶，发现7， 8q，11q，13q，20q和X的扩增以及1p， 8p， 17p，18q的缺失最为常见。该研究认为，在变异染色体中4种重现的断裂点位于1p1，8p12，17p11.2，20p12.1，又以17p11.2最为多见[13]。

采用FISH、aCGH技术，以发生肝转移和未发生转移或肝外脏器转移的原发性结直肠癌为标本进行比较，发现肝转移患者原发灶中染色体变化最为明显的是20q，其扩增倍数明显高于未发生肝转移组[5，14]，还有一部分染色体的变化表现为8q的扩增及18q的缺失[5，15]。

2 变异的染色体上与结直肠癌肝转移相关的候选基因(蛋白)

2.1 锌指蛋白 217(ZEN217)

原癌基因ZEN217定位于20q13.2，被认为是有可能驱动20q13扩增的靶分子。在结直肠癌肝转移灶中，ZEN217出现扩增的频率明显高于原发灶，未发生肝转移的患者其原发灶未出现该基因的多拷贝，提示ZEN217的扩增增加了结直肠癌肝转移的风险[16]。

2.2 细胞凋亡易感蛋白(chromosome segregation 1- like，CSE1L)

定位于20q13.13，编码一种输出蛋白，介导经典核定位信号(NLS)通路中输入蛋白-α的回收[17]。研究发现CSE1L/CAS的mRNA在肿瘤细胞中表达高于正常腺体细胞，该基因被干扰后结直肠癌细胞黏附能力下降，凋亡比例增加。免疫组化的方法显示，CSE1L/CAS在结直肠癌细胞胞质中的高表达与高TNM分期及浸润深度相关，高表达CSE1L/CAS的结肠癌细胞系HT- 29具有向肝脏转移的高风险，5/7的小鼠在注射HT- 29后出现肝脏转移灶而无其他脏器转移，提示该蛋白参与了结直肠癌细胞的肝转移过程[18]。

2.3 转录因子 E2F- 1

多种肿瘤细胞经常高表达转录因子E2F1[19]，基因定位于20q11.2， E2F1游离化后活化S期相关蛋白。现认为，E2F1活性的调节紊乱是肿瘤形成过程中的一个始发事件。通过芯片技术发现了越来越多的E2F1的靶分子，这些分子本身或它们作用的次级蛋白可能在转移过程中发挥了作用。Marian等用CGH及q- PCR的方法发现，结肠癌肝、肺转移灶中20q有普遍的扩增(16/18)，而E2F1拷贝数目在肝、肺转移灶中均值为4.1、3.9，在原发灶中的拷贝数为2.52[20]。

2.4 结直肠癌缺失蛋白(DCC)

定位于18q21.2，是公认的抑癌基因，编码一种穿膜蛋白，表达于大部分正常组织以及肠黏膜上，参与细胞- 细胞以及细胞- 基质间的相互调节，影响细胞生长、分化及转移的发生[21]。18号染色体的缺失在腺瘤向浸润性肿瘤的发展过程中呈上升趋势[22]，DCC被认为是这种杂合性缺失的靶基因。原发灶中DCC的缺失与患者的预后不良相关[23]，并可作为结直肠癌远处转移的预测指标，虽然这种预测的敏感性可能与患者的分期相关，在所有患者中敏感性为42%，特异性为71%，在Ⅱ期患者中阳性预测值为19%，阴性预测值为88%[24]。

2.5 Smad4(DPC4)

定位于18q21.1，该基因产物是TGF-β信号通路中介导细胞生长和发育相关的中间产物，Smad4与Smad2、Smad3形成一种复合物作用于细胞核上，并在此激活TGF-β转录过程中的多个相关基因[25]。已有多篇文献报道，Smad4表达的变化更多出现在进展性结直肠癌以及转移性结直肠癌中。免疫组化的方法显示，转移灶比原发灶更易发生Smad4缺失，肝转移灶比肝外转移灶的缺失更易发生[26]，当给Balb/c小鼠注射CT26- Smad4下调的细胞系时，小鼠发生肝转移的风险增加且小鼠肝转移灶的重量明显高于对照组，发生肝转移的小鼠平均生存时间明显低于对照组(26dvs44.5d)，说明Smad4能够抑制CT26在体内的肝转移倾向[27]。

2.6 MMP- 7(matrilysin、pump- 1)

定位于11q21- q22，负责正常情况下细胞外基质重塑及病理性的基底膜及基质的破坏。研究表明，携带有MMP- 7转导子的细胞在SCID小鼠体内更加具备向肌层侵袭及向肝脏转移的能力，转移灶中MMP- 7前体蛋白(pro- MMP7)表达高于正常肝组织[28]。有研究指出，入院时诊断有肝转移患者的MMP- 7阳性率(72%)高于5年后发生肝转移的患者(47%)，所有转移组患者原发灶MMP- 7的表达明显高于未发生转移组的患者，并且这种转移以淋巴循环途径居多[29]。新近研究指出，患者血清中MMP- 7水平与患者年龄、肿瘤直径及远处转移相关[30]。

2.7 PRL- 3(PTP4A3)

定位于8q24.3，编码一种位于细胞膜表面的酪氨酸磷酸酶，22kD。Saha等应用人基因表达系列分析(SAGE)首次证实，PRL编码的蛋白高表达于结直肠癌的肝转移灶，而几乎不表达于正常大肠上皮细胞表面，弱表达于腺瘤以及原发灶组织中[31]。Bardelli等扩大了转移灶的检测范围，发现PRL- 3只高表达于结直肠癌的大部分转移灶(肝、肺、脑、淋巴结)，而不在其他癌症的肝转移灶和原发灶中高表达，且这种高表达不源于基因的扩增[32]。Kato等证实PRL- 3基因在结直肠癌细胞肝转移的过程中所扮演的角色是增强细胞的活动性，敲除该基因后细胞的活动性及在肝脏形成的克隆明显减少[33]。也有报道认为它不仅能破坏原血管的基底层有助于肿瘤细胞的扩散，并能在转移灶有助于异常新血管的生成[34]。

2.8 NDRG1

NDRG1(cap43/rit42/RTP/Drg1/TDD5)是第一个被证实的转移抑制因子，位于8q24.2，NDRG1的过度表达能够明显抑制肿瘤细胞的转移能力，当给无胸腺的小鼠注入过量表达NDRG1的细胞系SW620后发现，只有23%的小鼠发生了肝转移而对照组有75%发生了肝转移[35]。SW480和SW620是来源于同一患者但转移能力不同的两株细胞系(SW620转移能力强)，当SW480细胞中的NDRG1基因被干扰后，其表型及转移能力均向SW620接近[36]。

2.9 C- Met

定位于7q21- 31，编码一种跨膜糖蛋白，与肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)结合[37]，可使细胞进入有丝分裂及抗凋亡程序[38]。C-Met编码的蛋白在血管重塑、细胞运动性能提高、生长、侵袭、分化、迁移发挥作用[38- 40]。Zeng等用PCR- LDR/FISH的方法发现，C- Met基因拷贝数目的增加在结直肠癌的原发灶中是一件小概率事件(9/247)，但原发灶中C- Met基因拷贝数目增加的患者发生肝转移的概率较高(6/9)，同时这类患者肿瘤细胞的浸润程度较深[41]。

2.10 CCR(chemokine receptor)

在Ghadjar等的研究中发现，CCR6在原发灶组织中表达虽不尽相同，但高表达CCR6的患者发生肝转移的概率(9/11)要远高于低表达CCR6的患者(2/21)，在多重回归分析中控制性别、年龄、病理分级等相关因素后，原发灶中CCR6的高表达可以作为预测肝转移的独立因子[42]，该基因定位于6q27。

3 血清中与结直肠癌肝转移相关的指标

3.1 miRNA

miRNA是长度为18～22的非编码核糖核苷酸片段，通过干扰转录或抑制翻译过程来调节靶基因的表达[43]。尽管miRNAs的数目在不断增加，但是只有少数miRNA具有原癌或抑癌基因的作用，并参与肿瘤的发病机制[44]。Cheng等用qPCR的方法在中国的Ⅰ～Ⅲ期结直肠癌患者中发现，血浆中高浓度的miR- 141与结直肠癌患者的远处转移相关，但与淋巴结转移无关[45]。Wang等用qPCR方法发现，结直肠癌肝转移患者外周血中miR- 29a含量高于未发生肝转移的患者，该标志物对于区分肝转移的敏感性达到75%[46]。

3.2 REG- Ⅳ

REG- Ⅳ定位于1p13.1- p12，编码的REG- Ⅳ属于钙依赖性凝集素超家族成员及EGFR/Akt/激活蛋白- 1信号通路的有效激活剂。用qPCR的方法证实，大于70%的结直肠癌患者体内均显示REG- Ⅳ表达上调[47- 48]。Oue等用免疫组化的方法发现，发生肝转移的结直肠癌患者REG- Ⅳ表达明显高于未发生肝转移的患者，随后ELISA的方法证实肝转移患者血清中REG- Ⅳ高于无肝转移的患者[49]。

上述可在血清中检测的新型指标还需要更多更大的基础实验及临床实验的验证才能推广到临床,目前在临床应用的广谱血清指标为CEA，虽然它能够提示肿瘤的发生，但是缺乏足够的及时性与敏感性。

4 基因突变

结直肠癌中最常见的体细胞突变位于PI3K/RAS- RAF信号通路中，通过PIK3CA、KRAS和BRAF基因的突变使得该通路达到过度活化的状态。这些突变的频率和热点在西方结直肠癌患者中已经明确，更多的研究倾向于它们的状态与患者对靶向治疗药物的敏感性及患者预后的研究。它们与肝转移发生的负相关性只在Bruin 等的研究中被报道，显示携带有20q扩增且无突变患者肝转移发生率高达61%，是其他患者肝转移发生率的3倍。因此，他们认为联合检测结直肠癌原发灶中20q扩增和PI3K信号通路基因突变可以很好地预测患者手术后发生肝转移的风险[50]。与此观点类似，新近有研究认为RAS基因突变能够预测结直肠癌肺转移的发生，但不能预测肝转移，肝转移患者中KRAS基因的突变频率低于其在结直肠癌患者中普遍公认的频率30%～40%，这从侧面说明了KRAS突变与肝转移的负相关性[51]。

5 表观遗传学指标

正如基因突变的发生，表观遗传学指标的改变也能推进结直肠癌病程的发展，在结直肠癌中研究得最为广泛的是DNA的异常甲基化，约有20%的结直肠癌患者表现为CIMP表型[52]。结直肠癌进程中常见的甲基化基因已被归纳总结[53]。Ju等用焦磷酸测序方法在53例Ⅰ～Ⅲ期、25例Ⅳ期及62例肝转移患者中发现，超过80%Ⅳ期及肝转移患者携带MGMT甲基化，部分肝转移患者携带TIMP3甲基化。CIMP阳性的患者出现复发及肝转移的时间要早于CIMP阴性的患者，TIMP3甲基化在肝转移组出现的频率(15.5%)明显高于Ⅰ～Ⅲ(3.8%)及Ⅳ期(0%)非肝转移患者。接下来作者利用MCAM发现绝大多数基因在原发灶和肝转移灶中甲基化状态一致，而UPK3A只在转移灶中表现为甲基化状态，作者认为在原发灶及转移灶表达不一致的基因才有可能在转移过程中发挥作用，所以该基因很有可能参与了肝转移的过程[54]。

综上所述，结直肠癌的肝转移是一个极为复杂的生物学过程，涉及到了多种遗传学及表观遗传学特征的改变，迄今还没有完善的评估指标。并且上述提及的预测模型只在西方患者中适用，国内尚无相关报道，但研究者们已经注意到了结直肠癌患者中染色体变异情况的普遍性，且20q的扩增是最常见的染色体变异之一[55- 57]。在结直肠癌肝转移这个多维化的变化过程中， 我们希望从不同的角度、不同的分子水平来找到更多与此过程相关的信息，最终将这样的信息转化为临床检测手段，来为结直肠癌患者提供更多的治疗指导。

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