自体DC CIK NK αβT γδT细胞治疗乳腺组织细胞肉瘤的临床研究

王铭栋 孟繁明 李红姬 杨 丽

（吉林省吉林市中心医院肿瘤科，132000）

自体DC CIK NK αβT γδT细胞治疗乳腺组织细胞肉瘤的临床研究

王铭栋 孟繁明 李红姬 杨 丽

（吉林省吉林市中心医院肿瘤科，132000）

目的 观察细胞因子诱导的自体DC、CIK、NK、αβT、γδT细胞治疗组织细胞肉瘤疗效。方法 抽取患者自体外周血60～100 mL，采用血细胞分离机收集其单核细胞，经细胞因子诱导并扩增CIK、NK、αβT、γδT细胞及DC细胞；用流式细胞仪检测其表型后，静脉回输CIK、NK、αβT、γδT细胞，皮下注射DC细胞，观察组织细胞肉瘤变化。结果 患者左乳肿块缩小＞50%，生活质量明显改善。结论 细胞免疫治疗是一种化疗后组织细胞肉瘤有效的治疗手段，具有广阔的临床应用前景。

DC细胞；CIK细胞；NK细胞；T细胞；组织细胞肉瘤

组织细胞肉瘤是一类罕见的、造血系统起源的，形态学和免疫表型显示为组织细胞分化的恶性肿瘤。乳腺组织细胞肉瘤更是十分罕见，目前无确切的治疗方法。随着免疫细胞生物学及免疫分子生物学的高速发展，细胞介导的过继性免疫治疗已成为肿瘤患者放化疗后的辅助治疗手段之一。其对于促进患者免疫系统重建、消除残留病灶及骨髓净化具有良好的应用效果。为了寻求一种安全、有效的治疗方法，观察自体免疫细胞治疗乳腺组织细胞肉瘤1例。现报告如下。

1 病例资料

患者女，51岁。因右乳腺癌保乳切除术后4年，并双乳组织细胞肉瘤化疗后8个月入院。患者于2009年诊断为右乳癌，在我院胸外科行右乳癌保乳切除术。术后病理示：右乳腺浸润性导管癌，无淋巴结转移。术后行TA方案化疗4周期。2011年6月，患者复查发现双乳肿物；左乳腺结节伴皮疹，皮疹颜色鲜红，无明显瘙痒；腰背部、右上肢散在黄豆大小肿块。之后于2011年7月就诊于当地某医院，行左乳腺外上象限切除术及右乳腺肿物及皮肤切除术。术后病理示：组织细胞肉瘤。行CHOP方案化疗4周期。2011年12月，患者因腰背部、右上肢出现散在的皮肤肿物，肿物增大伴瘙痒及疼痛而来诊。查体：体温36.3℃，心率82次/min，呼吸20次/min，血压140/90 mm Hg。腰背部及右上肢散在的皮肤肿物，颜色潮红，质硬；腰背部最大肿块约5 cm ×5 cm。双锁骨上淋巴结、颈部淋巴结、腋窝淋巴结未触及肿大。双乳腺见长20 cm切口瘢痕，愈合良好，左乳腺外侧3点位置触及3 cm×3 cm肿物，质硬，无触痛。双肺呼吸音清；心律齐；肝脾未触及；双下肢无水肿。入院后血常规、肝功、肾功化验正常。颈部淋巴结彩超未见异常；上腹彩超示脂肪肝；泌尿系彩超未见异常；妇科彩超未见异常。乳腺钼靶片示：左中乳见类圆形模糊淡片状影，边缘不清，双乳皮肤及乳头未见异常改变。胸部CT示：左乳下方见类圆形肿块。考虑患者病情进展，给予3个疗程细胞免疫治疗。

2 免疫治疗方法

2.1 治疗过程 用血细胞分离机提取患者外周血60～100 mL，分离其中单个核细胞。在生物实验室中，将体外单个核细胞用多种细胞因子共同培养一段时间后（一般需要1～2周），获得一群具有扩增能力、肿瘤杀伤作用显著、分泌细胞因子能力强的杀伤细胞（DC、CIK、NK、αβT、γδT细胞），再定期回输到患者体内，以发挥抗肿瘤作用。培养扩增后的第7天，给患者皮下注射DC细胞，静脉滴注αβT细胞；第14～19天分别回输NK、CIK细胞，CIK、αβT细胞，NK、γδT细胞，NK、CIK细胞，CIK、αβT细胞，NK、αβT细胞。患者共接受3个疗程的治疗。

2.2 CIK细胞和DC细胞的培养及检测 CIK细胞：采用FCS1640培养基，调整细胞浓度为5×105/ mL，第1天加入rh-干扰素-γ 1 000 U/mL；第2天加入抗CD3单抗50 μg/mL、IL-1-α 100 U/mL、IL-2 1 000 U/mL，培养2 d。更换培养液，培养7 d。流式细胞仪检测细胞数。DC细胞：进行外周单个核细胞培养后，获得贴壁单核细胞，加入完全培养基、GM-CFS 100 ng/mL、IL-4 500 U/mL。培养5 d后加入HSP复合物1 ng/mL，再培养6 d后收集悬浮的DC细胞[1]。

2.3 NK细胞培养及检测 用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞[2]。将无菌塑料平皿用羊抗鼠IgG 1 mL（0.1 mg/mL）包被10 h。用含5% NCS2的生理盐水洗3次。2×107个单核细胞中加入CD3单抗及CD8单抗200 μL，4℃孵育30 min。用含5% NCS2的生理盐水洗3次，并重悬细胞，调整浓度为5×106/mL；加入包被的平皿中，4℃孵育40 min。收集非黏附的细胞，计数后用流式细胞仪检测NK细胞表面标记的CD56及CD16分子。

2.4 γδT细胞和αβT细胞的培养及检测 选用固相抗体包被培养板，将分离的单个核细胞悬浮于FCS1640液体中，调整细胞浓度为5×105/mL，分别加入抗TCRγδ和抗CD3包被的培养板中，再加如IL-2 15 μL（1×105U/mL），于37℃、5% CO2的培养箱中培养，更换液体1次/2 d。采用TCRγδ-FITC和抗TCRγδ-PE荧光标记抗体，进行免疫荧光双染色，利用流式细胞仪分析所获细胞群的纯度[3]。

3 结果

患者第1个疗程结束后，腰背部、右上肢散在的皮肤肿块略缩小，缩小＜50%，瘙痒及疼痛症状消失，患者的生活质量有所改善。第2个疗程结束后，右上肢散在的皮肤肿块消失，腰背部肿块缩小＞50%，生活质量明显改善。第3个疗程结束，后患者左乳肿块缩小＞50%，腰背部肿块消失。胸部CT复查结果见图1～2。

图1 治疗前胸部CT

图2 治疗后胸部CT

4 讨论

组织细胞肉瘤属于侵袭性肿瘤，目前尚无统一的、疗效确切的治疗方案。组织细胞肉瘤发病过程虽然具有侵袭性特征，但部分患者发病时仍属局限性疾病，因此肿瘤大小可能是一个关系到预后的因素[4]。目前，恶性肿瘤治疗手段很多，包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗、中医药治疗、热疗和射频消融治疗等，但都缺乏特异性和靶向性。

近年来，细胞介导的过继免疫治疗已成为肿瘤患者放化疗后重要的辅助治疗手段之一。在抗肿瘤的免疫效应中，主要应答为T淋巴细胞介导的特异性细胞免疫，T淋巴细胞包括αβT细胞和γδT细胞两种亚型。αβT细胞主要参与机体的细胞免疫，需要DC细胞提呈抗原。由于肿瘤具有免疫逃逸机制，αβT细胞不能发挥有效的免疫应答。γδT细胞主要存在于肠道、皮肤、舌、食管、气管、肺和生殖系统的上皮细胞内，占外周血淋巴细胞总数的2%～5%，在肿瘤的先天性免疫监视和后天性免疫治疗中发挥着重要的作用[5]。DC细胞是抗原提呈细胞，可诱发抗原特异性免疫应答，抗原提呈细胞功能降低使肿瘤产生免疫逃逸。NK细胞不仅参与机体的非特异性免疫应答，而且还通过释放细胞因子来调节机体的特异性免疫反应[6]。CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等特点，对多重耐药肿瘤细胞同样敏感，能抵抗肿瘤细胞引起的效应细胞Fas-FaxL凋亡。5种细胞协同应用，能起到最大的效果。

本研究中，该患者化疗效果有限，耐受性差，我们选择细胞免疫治疗方案。通过3个疗程的治疗，患者肿块缩小＞50%，生活质量明显改善。而且免疫治疗过程中，患者耐受性良好，未见不良反应。

综上所述，细胞免疫治疗是一种化疗后组织细胞肉瘤有效的治疗手段，具有广阔的临床应用前景。

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Clinical Research in the Treatment of Breast Tissue Cell Sarcoma with Autologous DC CIK NK αβT γδT Cells

WANG Mingdong MENG Fanming LI Hongji YANG Li
(The Department of Tumour, Jilin Central Hospital, Jilin 132000, China)

ObjectiveTo observe the clinical curative effect of cytokine induced autologous DC, CIK, NK, αβT and γδT cells to breast tissue cell sarcoma.MethodsThe mononuclear cells were separated from autologous peripheral blood in 60～100 mL by blood cell separator. The killer cells of CIK, NK, αβT, γδT and DC were induced and multiplied by cytokine in vitro. Flow cytometry was used to test their phenotype. CIK, NK, αβT, γδT cells were used by intravenous injection, and DC cells was used by subcutaneous injection.ResultsThe tumor of the patient reduced above 50%, and his life quality was improved signifi cantly.ConclusionCellular immunotherapy provides an effective approach for the treatment of tissue cell sarcoma after chemotherapy, which could provide new prospects in the clinical application.

DC cell; CIK cell; NK cell; T cell; tissue cell sarcoma.

1672-7185（2014）24-0060-03 doi∶10.3969/j.issn.1672-7185.2014.24.030

2014-09-09）

R737

A