生长激素释放肽Ghrelin改善自发性糖尿病大鼠血管内皮损伤

李昭，白英龙，姜红堃，赵卫华，田文，程颖，宋立新，孙英贤，胡健

（中国医科大学1.附属第一医院心内科；2.公共卫生学院儿少卫生学教研室；3.附属第一医院儿科，沈阳110001）

生长激素释放肽Ghrelin改善自发性糖尿病大鼠血管内皮损伤

李昭1，白英龙2，姜红堃3，赵卫华1，田文1，程颖1，宋立新1，孙英贤1，胡健1

（中国医科大学1.附属第一医院心内科；2.公共卫生学院儿少卫生学教研室；3.附属第一医院儿科，沈阳110001）

目的明确外源性生长激素释放肽Ghrelin对糖尿病大鼠血管内皮损伤的影响，探讨其可能的内皮保护机制。方法大鼠编号随机分为3组：Wistar组（正常对照组），Wistar大鼠8只，蒸馏水灌胃4周；GK组（对照组），GK大鼠8只，同等容量蒸馏水灌胃4周；Ghrelin组（实验组），GK大鼠8只，外源性Ghrelin腹腔注射4周。留取大鼠动脉血液，采集血清和血管组织标本，检测血清内皮素1（ET-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平，计算胰岛素抵抗指数；采用免疫组化方法测量TNF-α蛋白表达。结果实验4周后，与Wistar组大鼠比较，GK组大鼠血清ET-1、TNF-α水平升高（P＜0.05）；Ghrelin组血清ET-1、TNF-α水平较GK组降低（P＜0.05）；Ghrelin组大鼠的胰岛素抵抗指数低于GK组（P＜0.05）。主动脉血管组织HE染色提示Ghrelin组大鼠血管内皮结构接近Wistar组；免疫组化结果显示Ghrelin干预后大鼠血管TNF-α表达量较GK组低（P＜0.05）。结论Ghrelin腹腔注射可减轻自发性糖尿病大鼠胰岛素抵抗，改善自发性糖尿病大鼠血管内皮损伤，其机制可能与较长期Ghrelin在体干预降低TNF-α血清水平及组织表达有关。

生长激素释放肽；胰岛素抵抗；肿瘤坏死因子α；内皮损伤

糖尿病血管病变是危害最大的一种慢性并发症，包括心脏的大血管、微血管以及周围血管病变，其发病机制有多种因素通过多种途径参与，其中内皮功能障碍是引起动脉粥样硬化的早期关键事件［1］，也是糖尿病血管病变的病理生理基础，改善或延缓内皮功能障碍是防治糖尿病血管并发症的重要途径。

小分子肽Ghrelin是1999年由Kojima等［2］从大鼠胃黏膜细胞分离纯化得到的一种由28个氨基酸组成的内源性促生长激素释放肽，随着其生物学作用领域的拓展及研究的深入，学者们发现其可促进血管新生、抑制炎症和血管内皮细胞凋亡［3～6］。新近有研究报道血浆Ghrelin浓度与患者颈动脉中膜厚度呈负相关，推测Ghrelin很可能可以降低动脉粥样硬化的发生率［7］。因此Ghrelin的血管保护效应受到越来越多的关注，但其确切的保护效应及作用机制尚有待探求。本研究应用外源性的Ghrelin注射于大鼠腹腔，采用免疫组织化学技术、放射免疫技术观察其对大鼠血管内皮及相关因子的影响，探讨Ghrelin确切的血管保护效应及其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

SPF级12周龄雄性自发性糖尿病大鼠（Goto-Kakisaki Wistar大鼠，简称GK大鼠）16只和SPF级12周龄雄性Wistar大鼠8只，购于上海斯莱科实验动物有限责任公司，合格证号为SCXK（沪）2003-0003。所有大鼠均在中国医科大学实验动物部SPF级饲养室分笼饲养大鼠置于昼夜节律光照条件下，自由进食饮水，室温控制在18～20℃，湿度60%～70%。随机分组干预4周后取血采集血清，并采集心肌、血管标本。外源性Ghrelin购于上海Sirocco Pharmaceutic公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组：大鼠编号，随机分为3组：Wistar组（正常对照组），12周龄雄性Wistar大鼠8只，蒸馏水灌胃4周；GK组（对照组），SPF级12周龄GK大鼠8只，同等容量蒸馏水灌胃4周；Ghrelin组（实验组），SPF级12周龄GK大鼠8只，外源性Ghrelin 200 μg·kg-1·d-1腹腔注射4周。

1.2.2 空腹血糖、血清内皮素1（endothelin 1，ET-1）及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）检测：应用葡萄糖氧化酶法进行空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）测定，空腹胰岛素（fasting plasma insulin，FINS）测定采用放射免疫法，参考文献［8］计算胰岛素抵抗指数（insulin resistance index，HOMA-IR）：HOMA-IR=FPG×FINS/22.5；血清ET-1和血浆TNF-α测定采用放射免疫法，参照说明书。

1.2.3 HE染色及免疫组织化学方法：主动脉组织HE染色参考文献［9］。免疫组化法测定TNF-α按照说明书进行，以PBS代替一抗为阴性对照，以细胞质中有棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞［10，11］。应用显微图像分析系统（中国医科大学实验设备处提供）对选取视野内免疫组化阳性信号进行光强度及面积分析，计算各组TNF-α光密度值，灰度积分值与染色面积和强度成反比，表达越强灰度积分值越低。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠主动脉组织HE染色

大鼠主动脉HE染色提示Wistar组（图1A）大鼠主动脉内膜较光滑；GK组大鼠（图1B）主动脉有散在内皮细胞肿胀、脱落，胶原纤维增生，局部内弹力板水肿、厚薄不均或分层；Ghrelin组（图1C）可见主动脉内膜较光滑，血管平滑肌细胞呈平行排列，细胞核大小均一，内弹力板无水肿。

图1 大鼠主动脉HE染色×400Fig.1 HE staining of the aorta×400

2.2 各组大鼠内皮损伤相关指标的比较

GK组大鼠的HOMA-IR、ET-1、TNF-α明显高于Wistar组和Ghrelin组（P＜0.05）；Ghrelin组的上述指标均明显低于GK组（P＜0.05），但与Wistar组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠主动脉TNF-α免疫组化染色

GK组大鼠主动脉TNF-α表达水平高于Wistar组（P＜0.05）；Ghrelin组大鼠的主动脉TNF-α表达水平低于GK组（P＜00.05）；Wistar组大鼠的主动脉TNF-α表达水平低于Ghrelin组，但二者比较无统计学差异（P＞0.05）。见表1、图2。

表1 3组大鼠HOMA⁃IR和血清ET⁃1及TNF⁃α水平比较Tab.1 Comparison of HOMA⁃IR，ET⁃1 and TNF⁃α levels

图2 主动脉组织TNF⁃α免疫组化染色×200Fig.2 Immunohistochemical staining of TNF⁃α in aorta×200

3 讨论

胰岛素抵抗的存在及大量炎性因子的生成是促进血管内皮功能不全的重要因素［12］。作为生长激素释放激素的内源性配体，Ghrelin的生物化学、生理及病理生理学、临床药理学等方面的研究日益增多并取得了较大进展。临床研究显示，低Ghrelin水平与胰岛素抵抗、高血压以及2型糖尿病相关［13］。分子水平的研究证明Ghrelin基因多态性与葡萄糖耐量受损个体发生2型糖尿病的危险性相关［14］。研究报道Ghrelin基因编码区的变异与肥胖和2型糖尿病有相关性［15］。本研究应用Ghrelin腹腔注射的GK大鼠HOMA-IR较未应用Ghrelin腹腔注射的GK大鼠下降，证实外源性Ghrelin可以改善GK大鼠的胰岛素抵抗。

实验中伴有严重胰岛素抵抗的GK大鼠在应用外源性Ghrelin后内皮结构得到显著改善，并且血清ET-1水平得以降低。ET-1是调节心血管功能的重要因子，其引起的血管收缩、心肌缺血、代谢紊乱和细胞增殖是血管疾病的关键致病因素［16～18］。腹腔注射外源性Ghrelin，使GK大鼠血清ET-1水平下降，证实Ghrelin可以改善GK大鼠的内皮功能障碍。我们从血管内皮损伤的发病机制最重要的环节——炎性反应学说探求其中可能的机制。TNF-α是炎性因子网络中的关键成分，过量的TNF-α作为炎性介质可直接或间接损伤血管内皮［19］。近年来研究机体胰岛素抵抗的发生与TNF-α含量升高密切相关［20］；TNF-α可引起葡萄糖转运蛋白4信使RNA膜两侧分布下降，又可抑制葡萄糖转运蛋白4的跨膜转运［21］，从而造成胰岛素介导的糖摄入下降，引起胰岛素抵抗。研究报道TNF-α可诱导内皮细胞合成释放ET-1，同时加速内皮型一氧化氮合酶信使RNA的降解，减弱基因启子的活性从而下调内皮型一氧化氮合酶的表达［22］，进而诱发内皮损伤及功能障碍。

本实验选用的GK大鼠是通过对Wistar大鼠进行口服葡萄糖耐量试验并筛选高血糖的个体进行培育而成。实验结果证实，GK组大鼠FINS和HOMA-IR明显升高，存在明确的血管内皮损伤改变，应用Ghrelin后GK大鼠血清放射免疫检测以及免疫组化结果提示TNF-α水平表达下降。我们推测，Ghrelin可能通过降低TNF-α水平，改善胰岛素抵抗以及调节ET-1表达，从而改善GK大鼠的血管内皮功能障碍，但具体传导信号通道尚需进一步探求。

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（编辑 陈姜）

Ghrelin Improve Spontaneous Vascular EndothelialInjury in Goto-KakisakiWistar Rats

LI Zhao1，BAI Ying-long2，JIANG Hong-kun3，ZHAO Wei-hua1，TIAN Wen1，CHENG Ying1，SONG Li-xin1，SUN Yingxian1，HUJian1
（1.Department of Cardiology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Child and Adolescent，School of Public Health，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China；3.DepartmentofPediatrics，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study whether exogenous growth hormone releasing peptide Ghrelin can improve diabetes vascular endothelial injury in rats，and explore its possible mechanism.MethodsRats were randomly divided into 3 groups：Wistar groups：4-week gavage with distilled water；GK group：4-week gavage with distilled water；Ghrelin group：intraperitoneal injection of exogenous Ghrelin in 4 weeks.The rats serum endothelin 1（ET-1），tumornecrosis factorα（TNF-α）levels，and insulin resistance index were determined.TNF-αprotein expression are measured by immunohistochemical method.ResultsAfter 4 weeks，serum ET-1 and TNF-α levels in GK group was higher than in Wistar group（P＜0.05）.ET-1 and TNF-α levels from Ghrelin group was reduced compared with GK group（P＜0.05）.HOMA index of Ghrelin group was lower than that of GK group（P＜0.05）.Vascular endothelial structure of Ghrelin group was close to Wistar group.Immunohistochemical results showed that the expression of TNF-αin Ghrelin group was lowerthan GKgroup（P＜0.05）.ConclusionIntraperitonealinjection ofGhrelin can reduce spontaneous diabetes rats with insulin resistance，and improves endothelial damage in spontaneous diabetes rats，the mechanism may be related to the longer-term Ghrelin intervention in reducing TNF-α.

growth hormone releasing peptide；insulin resistance；tumor necrosis factor α；endothelial damage

R543.5

A

0258-4646（2014）10-0902-04

高等学校博士学科点专项科研基金（20112104120002）

李昭（1975-），女，讲师，博士.

胡健，E-mail：meilichian@aliyun.com

2014-07-17

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