烟酰胺腺嘌呤二核苷酸对精子DNA碎片化指数的影响

李正涛，韩啸

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳110004）

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸对精子DNA碎片化指数的影响

李正涛，韩啸

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳110004）

目的研究烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）对精子DNA碎片化的作用，并探讨此过程中的分子生物学机制。方法在差异浓度NAD（0、1、10、100、1 000 μmol/L）孵育下，观察最适宜的精子NAD孵育浓度；采用BioVsion公司生产的NAD/NADH定量试剂盒测定精子NAD水平；采用流式细胞仪观察精子DNA碎片率和染色质成熟度；采用实时定量PCR观察精子DNA单链修复酶PARP1和双链修复酶BRCA1的转录水平。结果10 μmol/L NAD孵育即能显著增加精子NAD含量。在精子内NAD水平显著升高的同时，精子DNA碎片率明显降低，然而精子染色质成熟度不受精子NAD水平的影响。精子内NAD水平能显著影响精子内DNA单链修复酶PARP1和双链修复酶BRCA1的转录水平。结论这些结果初步提示，精子内NAD水平可能通过调节DNA修复系统，参与精子DNA损伤修复。

精子；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；DNA碎片指数

精子DNA损伤是精子染色质结构异常及遗传性状变化的一个重要特征，同时与男性不育、复发性流产、辅助生殖技术临床治疗失败密切相关［1，2］。因此，探索有效方法、增强精子DNA修复能力有显著的临床意义。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）广泛参与细胞内能量代谢、信号转导、增殖分化等生物学效应［3］。值得注意的是，NAD是聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）的辅助因子，过去研究证实PARP在单链DNA损伤修复及细胞凋亡中发挥重要的作用［4］，同时新近研究提示NAD广泛参与DNA双链修复因子乳腺癌易感基因1（breast cancer type 1 susceptibility protein，BRCA1）的转录调节［5］，因此本研究拟通过干预精子内NAD水平，观察精子DNA损伤与修复能力的变化。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选择2014年来我院就诊的男性不育患者，年龄22～37岁，平均（31.5±4.5）岁。精液常规分析各项指标均符合WHO手册中精液正常标准。有精索静脉曲张、酗酒、吸毒、生活或工作环境有污染的患者除外。禁欲2～7 d后，手淫法收集精液，37℃恒温水浴箱孵育，待完全液化后行精子DNA碎片检测，主要试剂均使浙江星博生物科技有限公司产品。

1.2 NAD孵育

37℃条件下，分别用0（对照组）、1、10、100或1 000 μmol/L NAD（美国Sigma公司）孵育精子3 h。

1.3 NAD含量测定

NAD测定方法采用美国BioVsion公司生产的NAD/NADH定量试剂盒完成。

1.4 实时定量PCR检测

RNA提取试剂购于美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒和PCR相关试剂（PrimeScript RT Master Mix kit，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ）购于日本TaKaRa公司，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。PARP1上游引物：5′-GAGTCGGCGATCTTGGA CC-3′，下游引物：5′-TGACCCGAGCATTCCTCG-3′；BRCA-1上游引物：5′-GGCTATCCTCTCAGAGTGAC ATTT-3′，下游引物：5′-GCTTTATCAGGTTATGTTG CATGG-3′；内参引物为GAPDH，上游引物：5′-AGG TGAAGGTCGGAGTCA-3′，下游引物：5′-GGTCATT GATGGCAACAA-3′。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 差异浓度NAD孵育后精子内NAD含量测定

在差异浓度（0、1、10、100、1 000 μmol/L）NAD孵育精子后，精子内NAD水平逐渐升高。如图1所示，与对照组相比，10 μmol/L NAD孵育即能显著增加精子内NAD含量，且差异有统计学意义（P＜0.05），但100和1 000 μmol/L NAD与10 μmol/L NAD相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 NAD孵育对精子NAD水平的影响Fig.1 NAD levels in sperms after incubation with different concentrations of NAD

2.2 流式细胞仪检测NAD干预后细胞内染色质及DNA稳定性

如图2所示，精子染色质成熟度不受细胞外NAD孵育的影响（P＞0.05），然而10 μmol/L NAD孵育精子后，精子DNA碎片率显著降低（P＜0.05）。这提示NAD可能参与细胞内DNA损伤修复，而非影响染色质成熟度。

图2 NAD孵育对精子DNA完整性和染色质成熟度的影响Fig.2 DNA fragmentation levels and stainability in sperms after incubation with NAD

2.3 实时定量PCR检测NAD干预后细胞内DNA修复酶的表达

图2结果提示，NAD诱导的DNA损伤修复能力改善，机制可能涉及DNA修复酶。因此，我们分别检测了NAD孵育精子后细胞内双链和单链修复酶BRCA1和PARP1表达水平变化。NAD孵育后，精子内NAD水平显著升高（P＜0.05）（图3A），BRCA1水平显著提高（P＜0.05）（图3B），然而DNA单链修复酶PARP1表达水平不受影响（P＞0.05）（图3C）。我们意外发现，伴随着精子NAD水平升高，细胞内PARP1活性显著升高（P＜0.05）（图3D）。

图3 NAD孵育对精子DNA损伤修复酶BRCA1和PARP1的作用Fig.3 Effects of NAD incubation on BRCA1 and PARP1 in sperm

3 讨论

近年来，不孕不育发生率显著升高［6］。已知男性少弱精子症是不孕不育的主要因素，主要表现为精液中精子的数量和（或）活力显著降低。然而，传统精液分析（精子活力、密度和形态等）虽是评价精液质量的重要指标，但却不能够完整、客观的反映出精子遗传物质（DNA）状态。众所周知，精子DNA的完整性是遗传物质能否正确传递给下一代的前提，在受精和胚胎发育中发挥重要作用。

近些年的研究也已经证实，精子DNA断裂水平与男性不育及精子数量和活力存在密切联系，且显著影响受精能力［7］。同时也有研究发现，精子DNA的完整度是胚胎能否发育到胚泡期的重要因素之一［8］。在辅助生殖过程中，DNA完整性缺损的精子可更高程度的导致流产和胚胎停止，这也意味着DNA完整性损伤的精子在某种程度上虽然可以成功完成受精和着床，但仍然会导致不良妊娠结局［9］。因此，研究精子DNA碎片的形成机制，建立更为有效的精子DNA损伤后治疗方法，对男性生育力的提高和改善辅助生殖结局，具有相当重要的临床意义。

本研究发现：（1）10 μmol/L NAD孵育即能显著增加精子内NAD含量；（2）在精子内NAD含量显著提升的同时，精子DNA碎片率明显降低，然而精子染色质成熟度不受精子内NAD水平的影响；（3）值得注意的是，精子内NAD水平能显著影响精子内DNA单链修复酶PARP1的活性和双链修复酶BRCA1转录水平。这些结果初步提示，精子内NAD水平可能通过调节DNA修复系统，参与精子DNA损伤修复。

综上所述，提高精子NAD水平似乎是影响精子DNA碎片率的一个有效手段。另外，在男性原因所致的不孕不育治疗过程中，关注精子遗传物质的状态，探讨改善精子DNA完整性的有效方法，将对男性生育能力的提高有显著意义。

［1］Evgeni E，Charalabopoulos K，Asimakopoulos B.Human sperm DNA fragmentation and its correlation with conventional semen parameters［J］.J Reprod Infertil，2014，15（1）：2-14.

［2］杨大磊，潘伯臣，何丽霞，等.体外受精-胚胎移植中不同授精浓度对胚胎质量及妊娠结局的影响［J］.中国医科大学学报，2014，43（1）：67-70.

［3］Imai SI，Guarente L.NAD+and sirtuins in aging and disease［J］. Trends Cell Biol，2014，24（8）：464-471.

［4］Schiewer MJ，Knudsen KE.Transcriptional roles of PARP1 in cancer［J］.Mol Cancer Res，2014，12（8）：1069-1080.

［5］Deng Y，Liu J，Han G，et al.Redox-dependent Brca1 transcriptional regulation by an NADH-sensor CTBP1［J］.Oncogene，2010，29（50）：6603-6608.

［6］Dunson DB，Baird DD，Colombo B.Increased infertility with age in men and women［J］.Obstet Gynecol，2004，103（1）：51-56.

［7］Kadioglu TC，Aliyev E，Celtik M.Microscopic varicocelectomy significantly decreases the sperm DNA fragmentation index in patients with infertility［J］.Biomed Res Int，2014，2014：695713.

［8］Seli E，Gardner DK，Schoolcraft WB，et al.Extent of nuclear DNA damage in ejaculated spermatozoa impacts on blastocyst development after in vitro fertilization［J］.Fertil Steril，2004，82（2）：378-383.

［9］Carrell DT，Liu L，Peterson CM，el al.Sperm DNA fragmentation is increased in couples with unexplained recurrent pregnancy loss［J］. Arch Androl，2003，49（1）：49-55.

（编辑 陈姜）

EffectsofNicotinamide Adenine Dinucleotide on Sperm DNAFragmentation

LIZheng-tao，HANXiao
（DepartmentofObstetricsand Gynecology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the effects of nicotinamide adenine dinucleotide（NAD）on sperm DNA fragmentation.MethodsSperms were incubated with 0，1，10，100 or 1 000 μmol/L NAD for screening of the optimum concentration of NAD intervention.NAD levels were determined by using NAD/NADH Quantification Kits according to the manufacturer′s instructions.DNA fragmentation index and high DNA stainability were evaluated by flow cytometry.Single and double stranded DNA repairenzyme were analyzed by realtime-PCR.Results10μmol/LNAD incubation can effectively increase the NAD content in sperms.Sperm DNA fragmentation was significantly decreased，along with the increased sperm NAD levels，buthigh DNAstainability was notaffected.Sperm single and double stranded DNArepairenzyme can be affected by sperm NAD levels.ConclusionTaken together，these results indicate that sperm NAD levels may be involved in sperm DNA damage repair through the regulation of the DNArepairsystem.

sperm；nicotinamide adenine dinucleotide；DNA fragmentation index

R321.1

A

0258-4646（2014）11-0999-04

李正涛（1981-），男，技师，本科. E-mail：lzt1220@aliyun.com

2014-09-01

网络出版时间：