PTSD样大鼠杏仁核神经元内质网分子伴侣钙网蛋白的表达

刘冬娟，肖冰，石玉秀

（中国医科大学基础医学院1.电子显微学研究室；2.组织胚胎学教研室PTSD研究室，沈阳110001）

PTSD样大鼠杏仁核神经元内质网分子伴侣钙网蛋白的表达

刘冬娟1，2，肖冰1，2，石玉秀1，2

（中国医科大学基础医学院1.电子显微学研究室；2.组织胚胎学教研室PTSD研究室，沈阳110001）

目的检测创伤后应激障碍（PTSD）大鼠杏仁核内质网分子伴侣钙网蛋白（CRT）表达的变化。方法建立无连续单一刺激（SPS）模型，随机将大鼠分为SPS刺激后1 d组（SPS1d）、7 d组（SPS7d）、14 d组（SPS14d）及正常对照组。应用免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应及透射电镜技术，检测各组杏仁核神经元CRT表达变化及观察神经元超微结构的改变。结果与正常对照组比较，SPS各组神经元CRT阳性表达均增加（P＜0.001），尤以SPS7d组最为明显。SPS各组神经元细胞核及粗面内质网均发生不同程度的改变。结论SPS可诱导PTSD样大鼠过度内质网应激，引发杏仁核CRT表达上调并通过内质网径路发生细胞凋亡。

创伤后应激障碍；杏仁核；神经元；钙网蛋白

创伤后应激障碍（posttraumatic stress disorder，PTSD）是人们经历巨大灾难后发生的以创伤经历回闪、高度警觉、回避行为为特征的精神疾病。PTSD是创伤后的一种心理失衡状态［1］。杏仁核作为边缘系统中重要的皮质下核团，在情绪性学习记忆及情绪行为中起关键性作用［2］。钙网蛋白（calreticulin，CRT，又称钙网素）是存在内质网的主要分子伴侣［3］，起着协助蛋白质正确折叠及钙库的作用。当非折叠蛋白在内质网沉积时，启动内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），引起内质网径路的细胞凋亡［4］。我们前期的研究表明PTSD时杏仁核神经元钙超载［5］，钙稳态失调，导致内质网应激，提示PTSD杏仁核恐惧加剧可能与内质网应激相关。目前有关杏仁核CRT变化的研究尚无报道。本研究拟采用免疫组织化学、RT-PCR方法及透射电镜技术，检测PTSD大鼠杏仁核神经元CRT的表达变化及神经元细胞超微结构的改变，旨从杏仁核神经元CRT表达变化参与内质网应激细胞凋亡径路入手，进一步揭示PTSD恐惧加剧发病的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

本研究实验动物选用Wistar健康成年雄性大鼠40只，体质量160～200 g，由中国医科大学实验动物中心提供。大鼠均常规实验室喂养，随机分为正常对照组、无连续单一刺激（single-prolonged stress，SPS）后1 d（SPS1 d组）、7 d（SPS7 d组）、14 d（SPS14 d组），每组10只。

1.2 SPS模型的建立

SPS模型的建立采用国际公用的PTSD-SPS方法［6］，具体步骤如下：（1）禁锢：将大鼠置入塑料瓶中，头朝瓶嘴，尾部露在外面，并用透明胶带将塑料瓶捆紧，水平放置2 h。（2）强迫游泳：将禁锢后的大鼠置入矩形水槽中强迫游泳20 min。矩形水槽高50 cm，边长24 cm，水深2/3水槽高度，水温24℃。（3）乙醚麻醉：强迫游泳后将大鼠放回笼中休息15 min，之后用乙醚麻醉至大鼠意识丧失。将大鼠放回笼中并常规饲养，第1天、第7天、第14天分别取材。

1.3 免疫组织化学光镜标本的制备

大鼠经0.4%戊巴比妥腹腔麻醉后暴露心脏，用4%多聚甲醛和0.25%戊二醛灌流固定，续固定6～10 h后，置于Holt′S液（以40%蔗糖、0.01 mol/L PBS液配制）中。用恒冷箱切片机行冰冻切片，厚为15 μm。

1.4 免疫组织化学染色及图像分析

将冰冻切片置于常温2 h，0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次；0.3%Triton 10 min×1次；3%H2O2室温孵育10 min；滴加5%BSA室温20 min，然后分别滴加一抗兔多克隆抗体CRT（英国Abcam公司，1∶500）湿盒中4℃过夜；0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次，滴加羊抗兔IgG（英国Abcam公司，1∶500）及SABC（SABC试剂盒，武汉博士德公司），均37℃孵育20 min。PBS液漂洗3次，DAB显色，脱水、透明、封片并于光学显微镜（日本OLYMPUS，BX60）下观察、摄片。每个实验组以PBS代替一抗作阴性对照。

应用MetaMorph/DPIO/BX41形态学图像分析系统软件进行图像半定量分析。每组大鼠共选取5张切片，在高倍（×400）视野下，每张免疫组化染色切片取5个视野，记录每个视野内阳性细胞光密度值，取平均光密度。

1.5 RT-PCR检测

大鼠处死后断头取脑，冰上快速分离杏仁核，利用Trizol试剂提取总RNA。分光光度计定量后，进行逆转录和PCR扩增。引物由上海生工生物工程技术公司合成，CRT的引物序列：上游5′-CAAGGATATCCGGTGTAAGGA-3′，下游5′-CATAG ATATTCGCATCGGGG-3′；β-actin的引物序列：上游5′-GTCACCCACACTGTGCCCATC-3′，下游5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3′。CRTPCR扩增条件：94℃5 min，94℃45 s，54℃45 s，72℃45 s，35个循环，72℃10 min；β-actinPCR扩增条件：94℃4 min，94℃40 s，58℃30 s，72℃30 s，30个循环，72℃8 min。扩增结束后取5 μL扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，利用天能GIS凝胶成像系统进行观察拍照并进行积分光密度分析，以目的条带与内参照β-actin的平均吸光度的比值表示相对表达水平，进行半定量分析。

1.6 透射电镜样品制备

取经4%多聚甲醛和0.25%戊二醛灌流固定的正常对照组和SPS各组大鼠杏仁核组织，于2.5%戊二醛中固定。常规透射电镜样品制备，经半薄切片定位、超薄切片70 nm，醋酸铀-柠檬酸铅染色，JEM-1200EX透射电镜下观察、摄片。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 免疫组织化学染色结果

CRT在各组杏仁核神经元中免疫组织化学阳性表达为棕黄色颗粒，定位于胞质内，胞核呈阴性反应。大鼠杏仁核在脑组织中的低倍像（图1A），正常对照组（图1B）细胞轮廓清楚，反应颗粒较少呈浅棕黄色。SPS各组CRT阳性细胞反应颗粒呈深棕黄色，以SPS7 d组（图1D）最为明显。与正常对照组的光密度值（78.6±8.4）比较，SPS1d组光密度值（101.0 ±11.2）、SPS7 d组的光密度值（120.7±12.1）和SPS14 d的光密度值（83.0±9.0）均明显增强，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 RT-PCR结果

PCR结果显示，正常对照组和SPS各组大鼠杏仁核中CRTmRNA均有一定的表达，SPS 1 d、7 d、14 d组CRTmRNA表达强于正常对照组。与正常对照组的光密度值（0.23±0.03）比较，SPS1 d组光密度值（0.44±0.38）、SPS7 d组的光密度值（0.86± 0.09）、和SPS14 d的光密度值（0.26±0.29）均明显增强，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.3 杏仁核神经元细胞的透射电镜观察

正常对照组神经元细胞边界清楚，核呈圆形、核膜光滑，核内以常染色质为主且分布均匀，胞质有丰富的线粒体、粗面内质网、核糖体、溶酶体等细胞器（图3A）。随着SPS刺激1 d、7 d和14 d的递增透射电镜下见SPS各组大鼠杏仁核神经元细胞超微结构均有不同程度的改变，SPS7 d组神经元核膜部分模糊，核内异染色质凝聚、边集，胞质有部分溶解，粗面内质网轻度扩张，线粒体多呈嵴减少或少量空泡化、溶酶体增多等改变（图3C）。SPS1 d组（图3B）和SPS14 d组（图3D）神经元核内染色质分布较均匀，核形多不规则有凹陷，核膜部分模糊，胞质内线粒体外膜较模糊、部分粗面内质网轻度扩张。

图1 杏仁核CRT免疫组织化学的表达×400Fig.1 Immunohistochemistry of CRT expression in the amygdaloid nucleus×400

图2 杏仁核CRT mRNA的表达Fig.2 CRT mRNA expression in the amygdaloid nucleus by RT⁃PCR

图3 透射电镜下各组PTSD大鼠杏仁核神经元×8 000Fig.3 The amygdaloid nucleus neurons of PTSD rats in each group under transmission electron microscope×8 000

3 讨论

PTSD等创伤性应激相关精神、行为异常是对创伤等严重应激因素的一种重度精神心理反应，PTSD的发生是个体内部因素和外部环境相互作用的结果。近年来随着战争、暴力、自然灾害等的频发，其发病率不断上升已引起国内外学者的极大关注。对PTSD发病机制的研究目前多见于前额皮质、杏仁核、海马等大脑部位［7］，杏仁核主司恐惧，有证据表明杏仁核参与调节多重记忆系统对情绪激发的感受性［8］。杏仁核还参与介导应激行为反应以及应激性自主神经活动和应激性神经内分泌的激活。

内质网是细胞内重要的细胞器，是调节蛋白质合成及合成后正确折叠的场所，也是调节细胞的应激反应及储存Ca2+的场所。Ca2+在内质网游离存在或以结合于CRT以腔内蛋白的形式存在，当内质网钙稳态破坏时，钙离子及其结合蛋白可作为促凋亡信使发挥作用而引起细胞凋亡。过度内质网应激是新的细胞凋亡信号传导通路，包括钙离子起始信号和非折叠蛋白反应等机制。内质网应激可因钙离子平衡失调所致［4］。ERS能激活从内质网到胞质和胞核的信号传导，并特异性激活Caspase12［9］，最终导致细胞凋亡。CRT作为内质网主要分子伴侣，参与内质网中Ca2+的存储，调节胞质内Ca2+平衡，从而在机体钙平衡中发挥重要作用。CRT通过调节内质网Ca2+贮存而影响细胞质游离Ca2+水平，具有调节Ca2+稳态、蛋白质折叠、细胞凋亡的作用，多种疾病（炎性脱髓鞘等）的发生与CRT失调内质网应激有关［10］。我们前期从线粒体路径（细胞色素C、Caspase 3、Caspase 9）及凋亡相关基因bcl-2/bax方面［11］探讨了PTSD大鼠杏仁核神经元细胞存在细胞凋亡。

本研究免疫组织化学结果与RT-PCR结果一致，显示SPS各组大鼠CRT蛋白水平较正常对照组显著上升，尤以SPS7 d组CRT蛋白水平明显增高，表明PTSD这种超强应激，可能会使内质网应激过度，使杏仁核活跃神经元内质网钙稳态破坏，未折叠蛋白或错误蛋白在内质网聚集，激活了未折叠蛋白反应。本实验结果与前期报道相吻合，CRT的高表达调节了内质网Ca2+贮存使细胞质游离Ca2+水平下降，进而协助处理未折叠蛋白反应。电镜下见杏仁核神经元细胞核内异染色质凝聚、边集等细胞凋亡的形态学特征；胞质内粗面内质网轻度扩张等改变，与CRT从内质网到胞质的转位可能影响细胞内游离钙离子浓度调节的凋亡发生［12，13］相似，提示PTSD杏仁核恐惧加剧可能与内质网应激相关，过强的ERS致内质网自稳功能受损，钙离子及其结合蛋白CRT作为促凋亡信使可能参与了PTSD样大鼠杏仁核神经元细胞凋亡的发生。

综上所述，PTSD致大鼠杏仁核过度内质网应激，引发CRT表达上调并通过内质网径路发生细胞凋亡，可能是导致PTSD大鼠恐怖加剧的重要病理生理学分子机制之一。

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（编辑 武玉欣）

Expression of Calreticulin in the Amygdaloid Nucleus Neurons of Rats with Posttraumatic Stress Disorder

LIUDong-juan1，2，XIAOBing1，2，SHIYu-xiu1，2
（1.DepartmentofElectron Microscopy，College ofBasic MedicalSciences，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China；2.DepartmentofHistology and Embryology PTSDLaboratory，College ofBasic MedicalSciences，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo observe the changes of Calreticulin（CRT）in the amygdaloid nucleus of rats.MethodsThe rats were randomly divided into fourgroups，one group served as normalcontrol，while others were induced forsingle-prolonged stress（SPS）modelas SPS groups（1 d，7 d，14 d）.Immunohistochemistry and RT-PCR were formed to examine the changes of CRT in the amygdaloid nucleus of rat；the neuron ultrastructure of amygdaloid nucleus was detected by transmission electron microscope.ResultsThe expression of CRT in the amygdaloid nucleus increased after SPS stimulation comparing with the normal control group（P＜0.001），and reached the peak in the group of SPS 7 d.There were obvious changes of neuron nucleus and the rough endoplasmic reticulum of amygdaloid nucleus at SPS groups.ConclusionPTSD induced endoplasmic reticulum stressin the amygdaloid nucleus and enhanced the expression ofCRT afterSPS stimulation.SPS stimulation also induced apoptosisthrough endoplasmic reticulum pathway in the amygdaloid nucleus.

posttraumatic stress disorder；amygdaloid nucleus；neuron；calreticulin

R329.4

A

0258-4646（2014）11-0978-04

国家自然科学基金（31200772）；教育部博士点基金（20132104110021）；辽宁省科学技术计划（2012225073）

刘冬娟（1962-），女，高级实验师，本科.

石玉秀，E-mail：shiyuxiu@163.com

2014-07-14

网络出版时间：