Pseudomonas sp. F-12发酵优化及转化合成半胱氨酸的研究

赵婧楠 李志敏 叶勤

（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

Pseudomonas sp. F-12发酵优化及转化合成半胱氨酸的研究

赵婧楠 李志敏 叶勤

（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

通过不同发酵策略对Pseudomonas sp. F-12以DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸（DL-ATC）为底物生产L-半胱氨酸的过程进行优化，以分批发酵和指数流加发酵的形式进行生产，将发酵过程中的DL-ATC浓度分别控制在5 g/L和15 g/L。结果表明15 g/L DL-ATC分批发酵生产L-半胱氨酸得到最高酶活为149.1 U/mL，比活为70.9 U/mg DCW；采用15 g/L DL-ATC两阶段指数流加发酵，可使最高酶活达到313.3 U/mL，提高为分批发酵的2.1倍。同时在两阶段发酵过程中，能减少DL-ATC用量为5 g/L。两阶段发酵过程采用不同流加策略，证明菌体得率对酶活水平有显著影响。首次考察了Pseudomonas sp. F-12全静息细胞转化合成L-半胱氨酸的主要影响因素。结果表明Pseudomonas sp. F-12的最适转化pH为8.0，最适转化温度为30℃。加入甲苯等有机溶剂改变细胞膜通透性，使得半胱氨酸产量比对照组提高7.16倍，最高摩尔转化率达到93.3 %。不同金属离子对转化影响不同，0.1 mmol/ L Fe2+对转化反应有促进作用，0.1 mmol/L Co2+、Zn2+、Ni2+等重金属离子有抑制作用。研究结果为微生物法发酵及全细胞转化合成半胱氨酸的后续工业化奠定了基础。

假单胞菌 L-半胱氨酸 DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸（DL-ATC） 发酵 生物转化

L-半胱氨酸（L-cysteine，C3H7NO2S，分子量121.12）是唯一的含巯基氨基酸，肽链之间以二硫键（S-S）连接［1］，化学性质活泼。L-半胱氨酸可作为呼吸系统药物，面团性质改良剂和美白用品等广泛应用于医药、食品和化妆品行业［2］。

目前我国半胱氨酸的工业生产主要采用毛发水解法，但该工艺在制备过程中产生大量废酸和废气，造成严重环境污染［3］。1977年，日本学者Sano等［4］发现嗜硫氮杂环戊烯假单胞菌（Pseudomonas thiozolinophilum）可以转化DL-2-氨基-Δ2-噻唑啉-4

羧 酸（DL-2- Amino-Δ2-thiazoline-4-carboxylic Acid）合成L-半胱氨酸。相比毛发水解法，微生物转化法具有工艺简单、环境友好等优点。其转化途经已进行详细研究，如图1所示［5-7］。日本已能在工业规模利用微生物法转化合成半胱氨酸，而我国仍然较多采用毛发水解法，因此开展微生物法生产L-半胱氨酸的研究十分有必要。

图1 DL-ATC转化半胱氨酸的途径

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 假单胞菌F-12（Pseudomonas sp. F-12），本研究室筛选保存［8］。

1.1.2 材料与试剂 DL-ATC（分析纯）购自天津试剂二厂，葡萄糖为食品级别。其他试剂为市售分析纯。

1.1.3 培养基 （1）种子培养基（g/L）：DL-ATC 15，KH2PO41，MgSO40.5，FeSO40.01，MnSO40.007。其中MnSO4，FeSO4溶液过滤灭菌加入，其余培养基121℃，灭菌20 min。（2）5 L罐分批发酵培养基（g/L）：DL-ATC 15，KH2PO41，MgSO40.5，FeSO40.01。MnSO40.007。其中MnSO4，FeSO4过滤灭菌加入，其余培养基121℃，灭菌20 min。（3）5 L罐两阶段发酵培养基（g/L）：葡萄糖2，KH2PO41，NH4Cl 2，MgSO40.5，FeSO40.01，MnSO40.007。 其中FeSO4和MnSO4过滤灭菌加入。补料葡萄糖为1 mol/L，25%的氨水调节pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 种子培养条件 将-20℃甘油管保存的假单胞菌500 μL接种于的250 mL摇瓶，装30 mL种子培养基。30℃，220 r/min摇床培养30 h。将一级种子液按1%-2%的接种量，接种于500 mL摇瓶，装液量为100 mL，30℃，220 r/min摇床培养12 h。

1.2.2 5 L罐分批发酵 5 L发酵罐，装2 L发酵培养基，按接种量10%进行接种。培养条件为温度30℃，通气量2 vvm，搅拌转速初始600 r/min，之后根据溶氧逐步提高。1 mol/L H2SO4控制发酵过程pH6.8-7.0。每1 h取样，测定菌浓和发酵产物，留样待测酶活。

1.2.3 5 L罐两阶段指数流加发酵 两阶段法生产半胱氨酸，第一阶段为菌体高密度生长阶段，以指数流加的方式流加葡萄糖，使菌体密度达到最大。第二阶段加入5 g/L或15 g/L DL-ATC诱导酶活。

发酵罐装液量2 L，接入二级种子200 mL，培养条件为温度30℃，初始搅拌转速600 r/min，初始通气量2 vvm。菌体生长阶段以25%氨水调节pH值，流加葡萄糖的浓度为1 mol/L。第二阶段以1 mol/L H2SO4加入调节pH值。

1.2.4 DL-ATC浓度对菌体生长及酶活影响试验5 L罐发酵收集发酵液100 mL，4℃、12 000 r/min离心20 min。将离心得到的菌体利用种子培养基洗涤两次，再重悬于20 mL的种子培养基中得到浓缩菌液。将浓缩菌液以2%的接种量加入到含有不同浓度DL-ATC的摇瓶中，30℃、220 r/min培养12 h，每2 h取样1次，每组试验两个平行对照。

1.2.5 假单胞菌F-12转化细胞的制备 将-20℃保存的菌株接种到装有30 mL种子培养基的三角瓶中，30℃、220 r/min培养30 h。将培养好的一级种子液按2%接种量接种到装有100 mL培养基的500 mL三角瓶中，30℃、220 r/min培养12 h。发酵液6 000 r/min、4℃离心10 min，弃上清液，将菌体用1 mol/L的磷酸缓冲液离心洗涤2次，得到转化反应所需的静息细胞。

1.2.6 pH对细胞转化反应的影响 用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲体系配制pH值为4.0、5.0、6.0、7.0的转化液，甘氨酸-氢氧化钠缓冲配制pH值为8.0、9.0、10.0的转化液。利用1 mol/L、pH8.0的磷酸缓冲液将静息细胞配制成OD为8.9的细胞悬液，置于水浴摇床（100 r/min）进行反应，每2 h取样1 mL，12 000 r/min、4℃离心10 min，取上清测定L-半胱氨酸含量。

1.2.7 温度对细胞转化反应的影响 配制pH为8.0，DL-ATC浓度为 10 g/L的转化液。利用上述转化液将发酵获得的静息细胞配置成OD为9.0的细胞悬液，分别在30℃、37℃、42℃、45℃水浴条件下进行转化，每2 h各取样1 mL，测定半胱氨酸含量。

1.2.8 细胞渗透剂对转化反应的影响 将培养细胞离心重悬，在菌液中分别加入1 mL甲苯、吐温80、氯仿、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），将各类有机试剂与细胞充分混匀，30℃混合培养20 min，12 000 r/min离心10 min弃去上清，加1 mL pH8.0的磷酸缓冲溶液重悬。取处理过的菌液作转化，转化液中DL-ATC浓度10 g/L。

1.2.9 金属离子对转化反应的影响 考察了Mg2+、Fe2+、Co2+、Al3+、Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+对转化的影响，配制含上述8种金属离子（0.1 mmol/L）的DL-ATC转化液。加入静息细胞，置于水浴摇床进行转化，每2 h取样1次，测定半胱氨酸含量。

1.2.10 分析方法

（1）菌体浓度采用浊度法测定。将培养的菌液按适当比例进行稀释，使用721型分光光度计在600 nm下检测发酵液的光密度（OD600）。

（2）发酵液中残留的DL-ATC采用岛津LC-20A型高效液相色谱仪测定［9］。色谱柱为C18柱（150 mm×4.6 mm，Wondasil，Japan），检测器为紫外检测器（SPD-20A），波长260 nm，柱温30℃，流动相为1∶1的超纯水和乙腈，流速为0.6 mL/min。

（3）酶活测定。在转化过程中有3种酶存在，这3种酶结合在一起形成半胱氨酸合成酶，其活性能反应完整细胞的转化能力［10］。检测表观半胱氨酸合成酶活性的方法：细胞放置于1.5 mL离心管中，4℃，12 000 r/min离心5 min，加入0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH8.0）洗涤2次，重悬于包含10 g/L DLATC的0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 8.0），42℃ 水浴15 min，加入200 μL 10%（W/V）盐酸停止反应，利用酸式茚三酮法测定半胱氨酸含量［11］。一个酶活单位定义为在上述标准条件下1 min产生1 μg L-半胱氨酸所需的酶量。单位菌体质量的酶活力定义为比活。

（4）半胱氨酸含量的测定。取待测发酵液于4℃，12 000 r/min，离心10 min，弃上清，沉淀用25 mL溶有10 g/L DL-ATC的磷酸缓冲溶液（pH8.0）重悬。42℃水浴摇床（100 r/min）中，反应10-12 h，每2 h取样1 mL。将样品12 000 r/min，室温离心10 min，取上清煮沸1 min，相同条件离心，再取上清利用酸式茚三酮法测定半胱氨酸含量。

2 结果

2.1 5 L罐15 g/L DL-ATC分批及两阶段发酵

图2 假单胞菌F-12 15 g/L DL-ATC分批发酵

5 L罐15 g/L DL-ATC分批发酵曲线如图2所示。整个发酵过程为10 h，发酵8 h溶氧迅速跳升，9 h达到最高OD 5.38。在0-4 h基本检测不到酶活的产生，说明此阶段DL-ATC用于菌体生长，没有诱导

出转化的酶。5 h之后开始产生酶活。在溶氧跳升点后1 h，酶活产生最大值为148.1 U/mL，比活为70.9 U/mg DCW。在发酵过程中，溶氧和菌浓可作为重要指标判断出酶活情况。溶氧跳升说明碳氮源物质供给不足，跳升后菌体浓度基本不再增加，此时DLATC消耗完全，产物积累最多，因此在溶氧跳升点产生酶活最大值。

分批发酵可知菌体生长和诱导酶活均依赖于唯一的碳氮源DL-ATC。因此若要降低成本，菌体生长阶段可采用较廉价的碳氮源如葡萄糖。Pseudomonas sp. F-12在以DL-ATC为碳氮源的分批培养情况下，最大OD值仅为5.38。由分批试验可知，Pseudomonas sp. F-12产生酶活与菌体浓度相关，若要获得较高的酶活需要提高菌浓。考虑降低成本，同时希望获得更高的酶活，故采用两阶段策略进行发酵。两阶段发酵第一阶段以葡萄糖为碳源，以氨水为氮源高密度发酵产生菌体；第2阶段一次性补加DL-ATC进行诱导。

图3 假单胞菌F-12 15 g/L DL-ATC指数流加发酵

如图3所示，葡萄糖作为碳源时菌体增加较快，在16 h菌体达到最大OD 29.1。生长阶段初期，生长速率会超过0.2 h-1以上，之后随限制性因素增加，代谢副产物大量积累，增长速率逐渐放缓。菌体达到最大OD加入DL-ATC进行诱导。诱导阶段溶氧逐渐下降，4 h后溶氧跳升发酵结束。在诱导后3 h，酶活最高，达到313.3 U/mL。指数流加发酵得到的最大单位酶活为分批发酵的2.1倍，有效提高了体积酶活，但是比酶活并未显著升高。主要原因是菌体生长阶段利用葡萄糖代谢，积累酸性物质，此酸性物质会影响菌体转化活力［8］。诱导后期，由于溶氧条件限制及代谢废物的积累导致菌体的比生长速率明显下降，大量菌体自溶，利用DL-ATC能力降低，因此菌体相对比活并无提高。

2.2 摇瓶试验对比不同浓度DL-ATC对生长和酶活的影响

摇瓶考察不同DL-ATC浓度对菌体生长和产酶的影响。由图4可知，DL-ATC浓度对于菌体生长有一定影响。在20 g/L DL-ATC发酵6 h下，菌体得到最高菌浓OD600为5.67。在5 g/L、10 g/L和15 g/L DL-ATC浓度下，菌浓最高值OD600分别为5.33，5.34和5.65，为20 g/L DL-ATC的94%，94.5%和99.6%，其结果相差不大。由图5可知，在DL-ATC浓度10 g/L时，酶活的诱导效果最好，达到13.12 U/mL。5 g/L、15 g/L和20 g/L DL-ATC浓度诱导的酶活分别为12.86 U/mL，12.73 U/mL，11.43 U/mL。酶活为10 g/L DL-ATC诱导的98%，97%和87%。摇瓶试验成功地将DL-ATC由原来的15-20 g/L降低为5-10 g/L。

图4 不同DL-ATC浓度对菌体浓度及酶活影响曲线

2.3 5 L罐5 g/L DL-ATC分批及两阶段发酵

5 L罐Pseudomonas sp. F-12的分批发酵，DLATC的量减少为5 g/L。发酵趋势与15 g/L DL-ATC差别不大，酶活测定结果见图5。

图5 假单胞菌F-12 5 g/L DL-ATC分批发酵过程中的酶活表达

5 L罐5 g/L DL-ATC分批发酵菌体OD达到最大值为3.19。 3-5 h比生长速率迅速升高，同时酶活逐渐增高。溶氧跳升后酶活达到最大为95.5 U/mL，比活为91.5 U/mg DCW。相比较15 g/L DL-ATC与5 g/L DL-ATC发酵情况，5 g/L DL-ATC菌体浓度为3.19，为15 g/L DL-ATC 最大菌体浓度的59.3%。5 g/L DL-ATC分批发酵最大酶活为95.5 U/mL，为15 g/L DL-ATC最大酶活148.1 U/mL的64.5%，而比酶活5 g/L DL-ATC分批发酵高于15 g/L DL-ATC分批发酵，说明5 L罐分批发酵降低DL-ATC浓度可行。

两阶段发酵降低DL-ATC浓度进行诱导，以两种控制不同比生长速率的策略考察对于酶活的影响。第一种策略以比生长速率0.2 h-1控制菌体生长，再以5 g/L DL-ATC进行诱导。第二种策略以比生长速率0.27 h-1控制菌体生长，再以5 g/L DL-ATC进行诱导，结果如图6和图7。

图6 假单胞菌F-12 5 g/L DL-ATC 指数流加发酵（策略1）

图7 假单胞菌F-12 5 g/L DL-ATC指数流加发酵（策略2）

第1种策略下的菌体最高OD为21.2，平均比生长速率为0.233 h-1，得率为0.296。第2种策略菌体最高OD为24.5，平均比生长速率为0.235 h-1，得率为0.241。两种情况比生长速率基本一致，但得率有较大差别。第一种情况体积酶活为62.99 U/mL，比活为16.4 U/mg DCW。第2种情况下体积酶活为60.4 U/mL，比活为6.63 U/mg DCW。得率不同，积累的代谢副产物有机酸的量不同，因此两种不同得率的情况酶活有较大差别。得率的高低和副产物的合成可与补碱消耗量相耦联分析。Pseudomonas sp. F-12利用葡萄糖的过程中，会产生有机酸，造成pH的下降。补入的氨水可以中和生成的有机酸，使发酵液保持恒定的pH。消耗氨水的量越多，说明副产物有机酸产生越多。在策略一得率0.296的情况下，消耗氨水量较少，为153.7 g。在策略二得率0.241的情况下，氨水消耗为208.4 g，说明此时有机酸产生量多。初步推断发酵过程中产生的未知有机酸，对于酶活有较大的影响。

2.4 转化合成研究

发酵获得全细胞后，研究不同pH，转化温度，底物浓度，不同表面活性剂及不同金属离子对其转化合成半胱氨酸的影响。

不同pH和温度对全细胞转化反应有显著影响（图8）。反应时间为8 h，pH值为8.0时合成L-半胱氨酸为1.65 g/L。当pH值大于9.0时，L-半胱氨

酸产量显著下降。pH值小于6.0时，几乎没有L-半胱氨酸生成。pH9.0转化合成半胱氨酸的量要大于pH7.0，说明Pseudomonas sp. F-12在碱性条件下的转化水平要优于中性及酸性条件。Pseudomonas sp. F-12最适转化pH值为8.0（图8-A），与此前文献报道的冻融细胞最适转化pH一致［12，13］。

考察在30、37、42、45℃条件下合成L-半胱氨酸的情况（图8-B）。转化温度为30和37℃时，L-半胱氨酸产量呈持续上升趋势。转化温度为42℃和45℃时，L-半胱氨酸产量在8 h时达到最大值，随后半胱氨酸转化量下降。分析原因为本试验使用静息细胞，未经冻融，细胞内物质没有破裂渗出，细胞内绝大多数酶在30-37℃为最适转化温度，转化温度在42℃以上，超过细胞体内酶的耐受范围，因此转化时间缩短且转化量较低。由前期试验可知冻融细胞的最适转化温度为42℃，本试验证明静息细胞与冻融细胞在转化温度上有较大差别。

图8 转化液pH值（A）和温度（B）对L-半胱氨酸合成的影响

表面活性剂显著降低表面张力，改变细胞通透性，使细胞内的酶系更易渗出，从而促进转化反应。不同表面活性剂对转化反应作用不同（表1）。甲苯的促进效果最为显著，为空白对照的7.16倍，最高摩尔转化率达到93.3%。CTAB的促进作用弱于甲苯，产量达空白对照的1.86倍。氯仿对转化略有促进作用。

金属离子对转化过程有不同程度的激活或抑制作用。试验考察了Mg2+、Fe2+、Co2+、Al3+、Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+对转化的影响（表2）。过高金属离子浓度会极大影响转化反应进行，而过低的浓度则不能体现出金属离子的影响，目前已知报道中多以浓度0.1 mmol/L为标准［14］。

相比较空白对照，Fe2+对转化反应的促进效果最显著，为空白对照的1.5倍。Co2+、Zn2+、Ni2+、Al3+等重金属离子对生物体往往具有毒性，这几种金属离子对于DL-ATC转化L-半胱氨酸具有明显抑制作用。在0.1 mmol/L 浓度下Mn2+、Ca2+、Mg2+等金属离子对转化反应影响不明显。

表1 表面活性剂对L-半胱氨酸合成的影响

表2 不同金属离子对L-半胱氨酸合成的影响

3 讨论

半胱氨酸在工业具有广泛用途，日本微生物法已能实现工业化生产，其摩尔转化率能达到100%。而我国微生物酶法仍处在实验室阶段。南开大学刘忠等［15］以DL-ATC为唯一氮源筛选到假单胞菌TS1138，鉴定其产物为L-半胱氨酸。怀丽华等［16，17］采用5 L发酵罐对TS1138菌株的补料分批发酵动力学及合成途径的代谢控制进行了研究。周昌平等［18］对酶促反应条件进行探讨，菌体42℃下

转化2.5 h，产物的质量浓度可达6 g/L。浙江大学吴敏［19］等以假单胞菌酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸，筛选到的菌株进行原生质体诱变后，最高转化量为10 g/L，摩尔转化率达到76.5%。这些研究仍然与工业化微生物法生产半胱氨酸具有较大差距，因此优化发酵过程，提高产量、转化率和降低成本具有深远意义。

在本试验中Pseudomonas sp. F-12分批发酵以DL-ATC为唯一碳氮源，DL-ATC既可作为反应底物也可作为酶活的诱导物，在发酵过程中能很快诱导出转化的酶活体系。发酵过程中平均比生长速率达到0.305 h-1，比生长速率较高，酶活相对较高，说明菌体活力能明显影响酶活。

两阶段发酵采用指数流加的方式控制菌体生长阶段葡萄糖流加量，以葡萄糖作为限制性底物。结果表明，Pseudomonas sp. F-12细胞具有快速代谢葡萄糖的能力，如葡萄糖浓度超过2 g/L，其发酵液中可检测到未知有机酸的存在。菌体在利用葡萄糖的过程中，过多的葡萄糖会导致副产物积累。

静息细胞转化反应，通过渗透处理可以促使底物进入细胞内与酶进行充分反应，同时也有利于转化产物被运输到到细胞外。加入表面活性剂或有机溶剂使得细胞渗透性增大，加快物质运输的能力。本研究通过在转化过程中加入渗透剂，增加细胞通透性，并且将细胞悬液置于摇床充分振荡，可有效增加细胞与渗透剂的接触，提高转化量7.16倍以上。在金属离子对于转化反应的影响过程中，可以在现结果基础上采用不同浓度梯度金属离子进行转化。提高Fe2+离子浓度，测定其能促进反应的浓度范围。降低Co2+、Zn2+、Ni2+、Al3+离子浓度，测定抑制范围。

4 结论

研究了不同发酵策略对Pseudomonas sp. F-12发酵生产L-半胱氨酸的影响。分批发酵控制DL-ATC浓度在15 g/L，最大体积酶活达到148.1 U/mL。两阶段发酵过程中，利用15 g/L DL-ATC进行诱导最高体积酶活为313.3 U/mL，提高酶活为分批发酵的2.1倍。利用5 g/L DL-ATC进行诱导最高体积酶活为62.99 U/mL，最高比酶活为16.4 U/mg DCW。较多代谢副产物的情况下，酶活受到一定影响，说明代谢产生的未知有机酸对于菌体诱导产生酶活有抑制作用。考察了转化液pH值、浓度，转化温度，不同渗透剂及金属离子等因素对于转化反应的影响。在转化液pH 8.0，加入1 mL甲苯的条件下，转化量提高至原来的7.16倍，摩尔转化率达到93.3%，是目前国内报道的较高转化水平。

［1］杨金奎, 何璧梅. 微生物方法生产L-半胱氨酸的研究进展［J］.国外医药：抗生素分册, 2001, 22（4）：179-183.

［2］贾存江, 王英燕, 赵丽丽. L-半胱氨酸的生产方法及应用进展［J］. 齐鲁药事, 2007, 26（9）：553-555.

［3］Yu Y, Liu Z, Liu C, et al. Cloning, expression, and identification of genes involved in the conversion of Dl-2-Amino-△2-Thiazoline-4-carboxylic acid to L-cysteine via S-carbamyl-L-cysteine pathway in Pseudomonas sp. TS1138［J］. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2006, 70（9）：2262-2267.

［4］Sano K, Yokozek K, Tamura F, et al. Microbial conversion of Dl-2-amino-△2-thiazoline-4-carboxylic acid to L-cysteine and L-cystine：screening of microorganisms and identification of products［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1977, 34（6）：806-810.

［5］Ryu O, Shin C. Analysis of the Reaction Steps in the Bioconversion of D, L-ATC to L-Cysteine, Korea, KR9700090［P］. 1991.

［6］Tamura Y, Ohmachi T, Asada Y. Induction of 2-amino-△2-thiazoline-4-carboxylic acid hydrolase and N-carbamoyl-L-cysteine Amidohydrolase by S-compounds in Pseudomonas Putida AJ3865［J］. The Journal of General and Applied Microbiology, 2001, 47（4）：193-200.

［7］Tamura Y, Nishino M, Ohmachi T, et al. N-carbamoyl-L-cysteine as an intermediate in the bioconversion from D, L-2-Amino-△2-thiazoline-4-carboxylic acid to L-cysteine by Pseudomonas sp. On-4a［J］. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1998, 62（11）：2226-2229.

［8］Fan CL, Li ZM, Ye Q. Two-stage cultivation of Pseudomonas Sp. F12 for the production of enzymes converting Dl-2-amino-Δ2-thiazoline-4-carboxylic acid to L-cysteine［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012, 168（7）：1867-1879.

［9］Yang B, Liu Z, Deng B, et al. Isolation and genetic improvement of Pseudomonas sp. strain HUT-78, capable of enzymatic production of L-cysteine from Dl-2-amino-△2-thiazoline-4-carboxylic Acid［J］.

The Journal of General and Applied Microbiology, 2011, 57（6）：379-386.

［10］Duan J, Zhang Q, Zhao H, et al. Cloning, Expression, characterization and application of atcA, atcB and atcC from Pseudomonas sp. for the production of L-cysteine［J］. Biotechnology Letters, 2012, 34（6）：1101-1106.

［11］Gaitonde M. A spectrophotometric method for the direct determination of cysteine in the presence of other naturally occurring amino acids［J］. Biochemical Journal, 1967, 104（2）：627-633.

［12］Huang Y, Zhao L, Dong T, et al. Optimization of enzymeproducing conditions of Micrococcus sp. S-11 for L-cysteine production［J］. Afr J Biotechnol, 2010, 10（4）：615-623.

［13］陈晓云, 杜军, 高智慧, 等. 恶臭假单胞菌TS1138透性化细胞的制备及其转化 DL-ATC生成L-半胱氨酸的特性研究［J］.南开大学学报, 2012, 45（4）：99-100.

［14］金永杰, 杨文博, 刘忠, 等. 假单胞菌L-半胱氨酸合成酶的纯化和性质研究［J］. 微生物学通报, 2004, 31（6）：68-71.

［15］刘忠, 杨文博, 白钢, 等. 微生物酶法合成L-半胱氨酸和 L-胱氨酸［J］. 微生物学通报, 2003, 30（6）：16-21.

［16］怀丽华, 周昌平, 陈宁, 等. L-半胱氨酸产生菌TS1138的补料分批发酵动力学研究［J］. 河南工业大学学报, 2007.28（1）：32-35.

［17］怀丽华, 寇广会, 周昌平, 等. 碳氮源对酶法合成L-半胱氨酸的影响［J］. 现代食品科技, 2006, 22（4）：85-87.

［18］周昌平, 寇广会, 徐庆阳, 等. 微生物转化法合成L-半胱氨酸的研究［J］. 现代化工, 2006, 26（2）：275-278.

［19］吴敏, 陈蔚青, 王普, 等. 假单胞菌酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸［J］. 氨基酸和生物资源, 2009, 31（1）：58-63.

（责任编辑 李楠）

Study on Fermentation and Conversion of L-cysteine by Pseudomonas sp. F-12

Zhao Jingnan Li Zhimin Ye Qin
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

L-cysteine has been widely applied in food and pharmaceuticals. In this study, different fermentation strategies of Pseudomonas sp. F-12 transforming DL-ATC to L-cysteine were investigated. The results showed that the highest enzyme activity of 15 g/L DL-ATC batch fermentation was 149.1 U/mL, specific activity was 70.9 U/mg DCW. The highest enzyme activity of two phase fermentation using 15 g/L DLATC was 313.3 U/mL, 2.1 times higher than the batch fermentation. The amount of DL-ATC was reduced to 5 g/L. In this study, the major factors on the biotransformation of L-cysteine by Pseudomonas sp. F-12 were investigated. The optimal reaction conditions for cells were 30℃, pH 8.0. The addition of organic solvents could change cellular permeability and enhance the production of L-cysteine by 7.16 times. The maximum conversion of L-cysteine was 93.3%. 0.1 mmol/L Fe2+benefitted the reaction, while 0.1 mmol/L Co2+, Zn2+, Ni2+and other heavy metal ions inhibited transformation.

Pseudomonas sp. F-12 L-cysteine DL-ATC Fermentation Bioconversion

2014-04-24

赵婧楠，女，硕士，研究方向：生物催化与基因克隆；E-mail：zhaojingnan0218@163.com

李志敏，女，博士，教授，研究方向：生物化工，发酵工程，代谢工程，微生物生理和代谢调控；E-mail：lizm@ecust.edu.cn