甘肃酒泉等地区豆科植物根瘤菌的遗传多样性和系统发育分析

李正 单辉辉 齐雅琳 刘磊 韩素贞

（首都师范大学生命科学学院，北京 100048）

甘肃酒泉等地区豆科植物根瘤菌的遗传多样性和系统发育分析

李正 单辉辉 齐雅琳 刘磊 韩素贞

（首都师范大学生命科学学院，北京 100048）

采用16S rDNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析技术对采集自甘肃酒泉、嘉峪关等8个地区的豌豆、菜豆等几个不同豆科植物根瘤中分离的53株供试菌株和9株参比菌株进行了遗传和系统发育分析。16S rDNA PCR-RFLP结果表明，在77.5%的相似性水平上全部供试菌株聚成5个分支。分支I为Sinorhizhobium-Rhizobium分支，分支II为Agrorhizobium-Bradyrhizobium分支，分支III是未知供试菌组成的分支，分支IV为Mesorhizobium分支，分支V为2株未知供试菌组成的分支。在89.8%的相似性水平上，分支I包括2个亚分支：亚分支1由CNU1008等14株供试菌组成，与Sinorhizobium meliloti LISPA1002T菌株聚在一起；亚分支2包括6株未知菌，与Rhizobium leguminosarum USDA 2370T聚在一起。分支II包括3个亚分支：亚分支1包括CNU 1041等4株菌，与2株Agrobacterium tumefaciens IAM 13129T和 IAM 13569T聚在一起；亚分支2包括5株菌，与Bradyrhizobium japonicum USDA 6T菌株聚在一起；亚分支3包括3株未知菌。选取各分支和亚分支的代表菌株进行16S rDNA测序，结果表明，两种分析方法在结果上具有较好的一致性。处于分支I的Sinorhizobium亚分支的菌株，与S.fredii和S.meliloti的相似性达到99%，该亚分支菌株的确切系统发育地位有待于DNA-DNA杂交来确定。处于分支I的Rhizobium亚分支的菌株，与R.giardinii的相似性达到99%，与R.etli的相似性为98%。同样，该亚分支的确切地位有待于DNA-DNA杂交来确定。处于分支II Agrobaterium亚分支的菌株与A.rubi的相似性达到99%。处于分支II Bradyrhizobium 亚分支的菌株，与B.liaoningense 的相似性达到99%。

根瘤菌 16S rDNA PCR-RFLP分析 16S rDNA全序列分析

根瘤菌与豆科植物的共生固氮体系是生物固氮中效率最高的体系，约占生物固氮总量的65%。该体系具有固氮能力强、固氮量大、抗逆能力强等特点，可以提高土壤肥力，对可持续农业的发展具有重要的意义。

16S rDNA已被作为一个分子指标，广泛地应用于各种细菌的遗传特征和分子差异的研究［1］。16S rDNA PCR-RFLP在研究根瘤菌的遗传多样性方面因其简便快捷的特点，应用已较成熟，与16S rDNA全序列分析结果具有很好的一致性［2，3］。

甘肃酒泉、敦煌、嘉峪关、甘谷、麦积山、德隆、泾川等地区属河西走廊地区，气候干燥寒冷，降水短缺。这些地区豆科植物根瘤菌种质资源的研究报道较少。本研究通过16S rDNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析对这些地区大豆根瘤菌多样性和系统发育进行研究，旨为这些根瘤菌菌株的应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

将采集自甘肃省河西走廊地区的根瘤用无菌水浸泡过夜，在无菌操作台上用95%乙醇浸泡5 min，用0.1% HgCl2表面灭菌5 min，再用无菌水冲洗6次，然后用镊子夹碎根瘤，挤出汁液，划线接种于YMA培养基，于28℃培养3-7 d后挑取单菌落划线纯化，进行革兰氏染色并镜检，将革兰氏阴性（G-）杆菌作为供试菌［4，5］。如表1，本研究采用53株宿主为豌豆、蚕豆、菜豆等豆科作物的供试菌和9株参比菌。参比菌分属于Sinorhizobium、Rhizobium、Agrobacterium、Mesorhizobium和Bradyrhizobium。

1.2 方法

1.2.1 16S rDNA PCR-RFLP DNA提取步骤详见参考文献［6］。引物P1为5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA GAACGAACGCT-3'，其序列对应于E.coli 16S rDNA基因第8-37 碱基位置；P6为5'-TACGGCTACCTT GTTACGACTTCACCCC-3'，其序列为对应第1479-1506 碱基位置［7］。16S rDNA PCR步骤详见参考文献［8］。用4 种限制性内切核酸酶HinfⅠ、MspⅠ、AluⅠ和Hae Ⅲ对扩增产物进行消化处理，Hinf I的酶切位点为5'-G/ATC-3'，MspI I为5'-C/CGG-3'，Alu I为5'-AG/CT-3'、Hae III为5'-GG/CC-3'，酶切体系为30 μL，37℃水浴过夜。酶切产物经3.0%琼脂糖凝胶 100 V电泳4 h、UV扫描后，文件用TIF格式保存［9，10］。将4种酶切图谱做均一化处理之后，把所得的酶切带型转化为“0”和“1”，即有条带记为“1”，无条带记为“0”，以平均连锁法（UPGMA）为基础聚类，通过NTSYS.2.10软件进行相似性分析，最后绘制成UPGMA树状图［11］。

1.2.2 16S rDNA 全序列分析 16S rDNA PCR扩增产物交由上海SanGon生物工程有限公司进行测序。将测得序列与GenBank中相关根瘤菌已知种序列，通过MEGA5.0中的ClustalW进行多序列比对，采用邻接法（neighbor joining method）、Kimura twoparameter 模型通过MEGA5.0构建系统发育树，通过自展值（Bootstrap）1 000进行置信度检测［12，13］。同时序列间的相似性也通过该软件加以计算。

1.2.3 BOX-PCR 指纹图谱分析 DNA提取同1.2.1。引物序列为BOXA1R：5'-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3'，扩增过程见参考文献［14］。BOX-PCR产物经 1.5%琼脂糖凝胶（含EB）电泳分离，电泳条件为70 V、2-3 h。电泳结束后，在凝胶成像仪中扫描凝胶，将指纹图谱用TIFF文件保存，之后对BOX-PCR指纹的电泳图像进行观察比较和分析。

2 结果

2.1 16S rDNA PCR-RFLP聚类分析

16S rDNA 扩增产生1 500 bp 左右大小的片段，53株供试菌株和9株已知参比菌株扩增产物经HinfⅠ、MspⅠ、AluⅠ和HaeⅢ 4种限制性内切核酸酶酶切，得到电泳图谱（图1）。

通过分析电泳图谱，得到了树状图（图2）。由图2可知，在77.5%的相似性水平上全部供试菌株聚成5个分支。分支I为Sinorhizhobium-Rhizobium分支，分支II为Agrorhizobium-Bradyrhizobium分支，分支III是16株未知供试菌组成的分支，分支IV为Mesorhizobium分支，分支V为2株未知供试菌组成的分支。在89.8%的相似性水平上，分支I包括2个亚分支：亚分支1由CNU1008等14株供试菌组成，与Sinorhizobium meliloti LISPA1002T菌株聚在一起，涵盖泾川、甘谷、嘉峪关、麦积山、德隆和敦煌等6个采样地区，宿主主要是大豆、豌豆、菜豆。亚分支2包括6株未知菌，与Rhizobium leguminosarum USDA 2370T聚在一起，分离自酒泉和德隆地区，宿主为菜豆和蚕豆。分支II也包括3个亚分支：亚分支1包括CNU 1041等4株菌，分离自德隆、酒泉和泾川地区，宿主为豌豆、菜豆和大豆，与2株Agrobacterium tumefaciens IAM 13129T和 IAM 13569T聚在一起；亚分支2包括5株菌，分离自麦积山、酒泉、嘉峪关和敦煌等地区，宿主为大豆、蚕豆和豌豆，与Bradyrhizobium japonicum USDA 6T菌株聚在一起；亚分支3包括3株菌，分离自甘谷和高平地区，宿主为大豆和菜豆。分支III包括16株未知菌，分离自嘉峪关、甘谷、德隆、麦积山和敦煌地

区，宿主为蚕豆、大豆和菜豆。分支IV包括4株Mesorhizhobium的参比菌。分支V包括2株未知供试菌，分离自酒泉和高平地区，宿主为大豆和菜豆。

表1 供试菌一览表

图1 部分菌株16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱

2.2 16S rDNA全序列测定和系统发育分析

依据16S rDNA PCR-RFLP聚类结果，选取各分支代表菌株1-3株进行16S rDNA全序列测定，并依此序列构建了系统发育树状图（图3）。图3显示，16S rDNA测序结果与16S rDNA PCR-RFLP的结果基本一致。菌株CNU 1001、1004、1006和1008处于分支I的Sinorhizobium亚分支，与S.fredii的相似性达到99%；菌株CNU 1009也处于分支I的亚分支1，与S.meliloti的相似性达到99%。该亚分支菌株的确切系统发育地位有待于DNA-DNA杂交来确定。菌株CNU 1014和1036处于分支I的Rhizobium亚分支，与R.giardinii的相似性达到99%，而该分支的另一株菌CNU 1032与R.etli的相似性为98%。因此，该亚分支的确切地位有待于DNA-DNA杂交来确定。处于分支II Agrobaterium亚分支的菌株CNU 1039和1041与A.rubi的相似性达到99%。CNU 1031和 1049处于分支II Bradyrhizobium 亚分支，与B.liaoningense 的相似性达到99%。从测序结果还可以看出（图3），从根瘤中可以分离到非根瘤菌：处于分支II亚分支3的菌株CNU 1011、1012和1046属于Brevibacillus，与B.reuszeri的相似性达到99%以上；处于分支III的菌株CNU 1016、1028和1037属于Enterobacter，与E.aerogenes的相似性达到99%以上；菌株CNU 1034处于分支V，与Candidatus Roseomonas massiliae的相似性达到99%以上。

2.3 BOX-PCR指纹图谱

分支ISinorhizobium亚分支的菌株CNU 1001、1004和1006的16S rDNA序列相似性达到100%，Rhizobium亚分支的菌株CNU 1014和1036的相似性也达到了100%（图3）。对这些菌株进行了BOXPCR（图4）。从图4可以看出，它们的BOX指纹图谱不一样，所以不是相同的克隆。

3 讨论

3.1 分离自大豆、蚕豆、豌豆和菜豆等宿主的根

瘤菌有很大的遗传多样性

从甘肃河西走廊地区大豆分离到26株菌，经16S rDNA PCR-RFLP及序列分析表明，其中9株属于S. fredii或S.meliloti，4株属于B.liaolingense，其余13株属于非根瘤菌的A.rubi、Candidatus Roseomonas massiliae、B.reuszeri 和E.aerogenes。从蚕豆分离到的11株菌，2株属于R.giardinii或R.etli，1株属于B.liaolingense，其余8株菌属于非根瘤菌的E. aerogenes。从豌豆分离到的6株菌，2株属于S. fredii或S.meliloti，1株属于R.giardinii或R.etli，1株属于B.liaolingense，2株属于非根瘤菌A.rubi，。从菜豆分离到的10株菌，3株属于S. fredii或S.meliloti，3株属于R.giardinii或R.etli，其余的4株属于非根瘤菌的A.rubi，B.reuszeri 和E.aerogenes。可见从这些地区分离到的大豆等宿主的根瘤菌有较大的遗传多样性。

图2 16S rDNA PCR-RFLP聚类图

张红侠等［14］采用BOX-PCR、16S rDNA PCRRFLP、16S-23S IGS PCR-RFLP 和16S rRNA 基因序列分析方法对分离自我国黄土高原地区山西、陕西、宁夏和甘肃4个省的15个地区的130 株大豆根瘤

菌及部分参比菌株进行了遗传多样性和系统发育分析。3 种方法聚类分析结果基本一致，可将所有供试菌株分为Sinorhizobium和Bradyrhizobium两大类群。从系统发育来看，供试的快生大豆根瘤菌为S. fredii，慢生大豆根瘤菌为B. japonicum和辽宁慢生B. liaoningense。从甘肃分离到的4株大豆根瘤菌都属于S. fredii。Camacho等［15］认为，S. fredii是中国大豆根瘤的优势种。本研究中大豆根瘤菌的遗传和系统发育分析结果与上述报道基本一致，但表现了更大的遗传多样性。

图3 16S rDNA 全序列系统发育树状图

图4 BOX-PCR 指纹图谱

路敏琦［16］等采用数值分类、16S rDNA PCR -RFLP、IGS PCR -RFLP等方法对分离自我国11个省的50株蚕豆根瘤菌及11株参比菌株进行了表型测定、遗传型研究和16S rDNA 全序列测定。试验结果表明我国蚕豆根瘤菌具有极大的表型多样性和遗传多样性，蚕豆根瘤菌的代表菌株均位于Rhizobium系统发育分支，与R. leguminosarum USDA2370的全序列相似性达99. 9%，说明蚕豆根瘤菌属于Rhizobium，系豌豆根瘤菌的一个生物型。Tian等［17］对从江西、安徽等地的蚕豆中分离到的根瘤菌进行了16S rRNA基因的系统发育分析和atpD和recA基因序列，表明这些菌株为属于Rhizobium的新种，即

Rhizobium fabae。本研究中分离自蚕豆的根瘤菌2株属于R.giardinii或R.etli，确切地位需要DNA-DNA杂交试验来确定，但有1株菌属于B.liaolingense，这一结果尚属首次报道。

从豌豆上分离的菌株只有一个种，即R. leguminosarum。杨成运等［18］利用16S rRNA PCRRFLP、16S rRNA 基因序列分析以及16S-23S rRNA IGS PCR-RFLP 对分离自我国江苏盐城、浙江温州、湖北仙桃及重庆等亚热带地区的42株分离自豌豆的根瘤菌进行了群体遗传多样性的研究。结果表明，40株菌属于R.leguminosarum USDA2370，2株菌与R. etli CFN42 相近。本研究与上述报道有相似之处，即从豌豆分离到的6株菌中，1株属于R.giardinii或R.etli，但是其余5株菌中，有2株属于S. fredii或S.meliloti，2株属于A.rubi，1株属于B.liaolingense，同样显示了很大的遗传多样性。

从菜豆中分离的根瘤菌分属于Rhizobium、Sinorhizobium和Burkholderia，已确定了13个种，表现了极大的多样性［19，20］。本研究中分离到的菜豆根瘤菌3株属于S. fredii或S.meliloti，3株属于R.giardinii或R.etli。

3.2 从甘肃河西走廊采集的根瘤中存在非共生的内生菌

从1957年开始就发现根瘤中存在除根瘤菌以为的其他微生物类群［21］，Muresu 等［22］对这方面的研究进行了总结，提出了根瘤内生菌的概念。不同豆科植物根瘤内的非共生内生菌种类并不完全相同，报道比较多的是Bacillus、Pseudomonas、Enterobacter和 Klebsiella等。在菜豆根瘤中，Mhamdi 等［23］发现除了根瘤菌，Agrobacterium被证实通过与根瘤菌共接种，可以侵入新的根瘤，并影响它们的接瘤特性［24］。邓振山等［25］从我国西北地区采集的苦马豆根瘤中分离并获得65株根瘤内生菌，通过基于16S rDNA 全序列分析表明，这65株菌分别归属于3个不同的门：变形菌门（Proteobacteria，G-菌）、放线菌门（Actinobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes，G+菌），并表现出丰富的遗传多样性。在变形菌门中有4个菌株属于α-变形菌纲（Paracoccus、Sphingomonas、Inquilinus）；11 个属于γ-变形菌纲（Pseudomonas和Serratia）；6 个菌株分别归属于放线菌门中的Mycobacterium、Nocardia 和Streptomyces；有45 株分别归属于厚壁菌门中的Paenibacillus、Brevibacillus、Staphylococcus、Lysinibacillus 和Bacillus。

本研究从大豆、蚕豆和菜豆中分离到了非共生内生菌。从大豆根瘤中分离到的非共生内生菌13株，属于A.rubi、Candidatus Roseomonas massiliae、B.reuszeri和E.aerogenes。从蚕豆根瘤中分离到的8株菌是E. aerogenes，从菜豆根瘤中分离到的4株菌属于A.rubi、B.reuszeri 和E.aerogenes。其中，Candidatus Roseomonas massiliae目前未见报道。

根瘤内生菌可能随着根瘤菌的侵染而进入植物根部，并最后出现在植物根瘤内。当内生菌与根瘤菌共同接种时，促进了其生长，从而也有利于植物的生长，能否也扩大宿主范围到非豆科植物有待于进一步研究［25］。

4 结论

16S rDNA PCR-RFLP及16S rDNA全 序 列 分析表明，其中9株属于S. fredii或S.meliloti，4株属于B.liaolingense，其余13株属于非根瘤菌的A.rubi、Candidatus Roseomonas massiliae、B.reuszeri和E.aerogenes。从蚕豆分离到的11株菌，2株属于R.giardinii或R.etli，1株属于B.liaolingense，其余8株菌属于非根瘤菌的E. aerogenes。从大豆分离到的6株菌，2株属于S. fredii或S.meliloti，1株属于R.giardinii或R.etli， 1株属于B.liaolingense，2株属于非根瘤菌A.rubi，。从菜豆分离到的10株菌，3株属于S. fredii或S.meliloti，3株属于R.giardinii或R.etli，其余的4株属于非根瘤菌的A.rubi，B.reuszeri和E.aerogenes，显示丰富的遗传多样性。

BOX-PCR指纹图谱研究表明，CNU1001、CNU1004和CNU1006三者并非同一菌株的克隆；CNU1036和CNU1014确定为贾氏根瘤菌（R.giardinii）的两个不同的菌株。

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（责任编辑 李楠）

Diversity and Phylogeny of Rhizobium Isolated from Root Nodules of Legumes in Jiuquan and Other Regions，Gansu

Li Zheng Shan Huihui Qi Yalin Liu Lei Han Suzhen
（College of Life Science of Capital Normal University，Beijing 100048）

The 16S rDNA PCR-RFLP and 16S rDNA sequence analysis were used on genetic and phylogeny of 53 strains isolated from Glycine max, Vicia faba, Pisum sativum and Phaseolus vulgaris of Jiuquan and other regions, Gansu and 9 known strains. Results of 16S rDNA PCR-RFLP indicated that all isolates included 9

trains were clustered into 5 branches at 77.5% similarity. Branch I was Sinorhizhobium-Rhizobium, branch II Agrorhizobium-Bradyrhizobium, branch III unknown bacteria branch, branch IV Mesorhizobium, and branch V also unknown branch. Branch I included 2 sub branches at 89.8% similarity：Sub branch 1 included strains CNU1008 and 14 strains witch clustered with Sinorhizobium meliloti LISPA1002T, Subbranch 2 included 6 strains which clustered with Rhizobium leguminosarum USDA 2370T. Branch II included 3 sub branches：Sub branch 1 included CNU 1041 and other 3 strains witch clustered with 2 strains of Agrobacterium tumefaciens IAM 13129Tand IAM 13569Ttogether, sub branch 2 included 5 strains which clustered with Bradyrhizobium japonicum USDA 6T, sub branch 3 included 3 unknown strains. Representative strains were selected in the analysis of 16S rDNA sequencing, and the results show that 16S rDNA PCR-RFLP and16S rDNA sequencing analysis were in good agreement. Strains of Sinorhizobium sub branch of branch I were clustered with S.fredii and S.meliloti at 99% similarity, and their exact system status should be determined by DNA-DNA hybridization. Strains of Rhizobium sub branch of branch I were clustered with R.giardinii at 99% similarity and with R.etli at 98% similarity. So the exact position of

Rhizobia 16S rDNA PCR-RFLP 16S rDNA sequencing

2014-04-10

李正，男，硕士研究生，研究方向：细菌分类；E-mail：lizheng2014@gmail.com

韩素贞，女，博士，副教授，研究方向：细菌分类，E-mail：hansuzhen@vip.sina.com

the sub branch waited for DNA-DNA hybridization to determine. Strains of Agrobacterium sub branch of the branch II clustered with A.rubi at the similarity of 99%. Strains of Bradyrhizobium sub branch of the branch II were clustered with B.liaoningense at the similarity of 99%.