人工合成的纳豆激酶基因转化烟草的研究

刘靓蕾 张妍 孙晓蕾 韩岚 满达呼斯琴 哈斯阿古拉

（内蒙古大学生命科学学院 内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，呼和浩特 010021）

人工合成的纳豆激酶基因转化烟草的研究

刘靓蕾 张妍 孙晓蕾 韩岚 满达呼斯琴 哈斯阿古拉

（内蒙古大学生命科学学院 内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，呼和浩特 010021）

根据植物偏爱密码子人工合成的纳豆激酶基因sNK和其中插入番茄果实特异表达基因E8第一内含子的纳豆激酶基因sNK-E8i，通过农杆菌侵染的方法转化到烟草NC89中。经PCR检测，得到12株转sNK基因烟草植株和10株转sNK-E8i基因烟草植株，初步证明目的基因已整合到烟草基因组中；RT-PCR检测有9株转sNK基因烟草植株和10株转sNK-E8i基因烟草植株为阳性；通过RT-qPCR将两种基因在烟草中的表达量进行比较，结果表明转sNK-E8i基因的植株中纳豆激酶的表达量比转sNK基因的植株中高；通过纤维蛋白平板法检测其活性，共有5株转sNK基因烟草植株和3株转sNK-E8i基因烟草植株检测到溶圈，说明目的基因在部分转基因烟草中可正常转录和翻译并表现出溶栓活性。经加代培养已得到T1代转基因植株。

纳豆激酶 人工合成 植物偏爱密码子 烟草 纤维蛋白平板法

纳豆激酶（nattokinase，NK）是Sumi等［1］于1987年首先在日本传统发酵食品纳豆中发现并命名。该酶是由纳豆枯草杆菌（Bacillus subtilis var. natto）产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶，具有非常高的溶栓活性。1992年，Nadamura等［2］首次克隆了纳豆激酶基因并测定了全基因序列，使得利用基因工程技术生产纳豆激酶成为可能。2004年，张淑梅等［3］使纳豆激酶基因在E. coli DH5α中实现了分泌型表达，表达的目的蛋白占菌体总蛋白的21.5%，经分离纯化得到的纳豆激酶蛋白干粉活性高达2 000 U/mg。2007年，黄磊等［4］在蛋白缺陷型枯草芽孢杆菌中表达了纳豆激酶原基因和只编码纳豆激酶成

熟肽的纳豆激酶基因，两者的表达产物均具有溶栓活性。2010年，蔡立涛等［5］实现纳豆激酶在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达，并以纯化产物为抗原制备兔抗纳豆激酶血清，经检测表达产物具有较好的溶栓活性和免疫原性。

由于当前的纳豆激酶表达系统多以微生物表达系统为主，因此纳豆激酶的生产一般使用的是通过液体发酵罐分离提取纳豆激酶菌株的方法。但是此种生产方式在下游加工工艺方面，如工程菌的发酵、表达产物的分离纯化等仍需较高成本。而植物生物反应器同其相比，具有品质高、安全性好等优势，且其成本仅为微生物培养的2%-10%。因此，有部分学者开始将方向转向了以植物生物反应器为载体生产纳豆激酶的研究。2005年，张锋等［6］构建获得了纳豆激酶基因植物表达载体并将其整合到番茄基因组中，但没有对转基因植株中纳豆激酶的活性和含量进行测定。2009年，张静等［7］将编码纳豆激酶基因成熟肽序列转化到烟草及番茄中，得到的转基因植株中纳豆激酶基因可正常表达并具有溶栓活性。

但是，以植物生物反应器生产药用蛋白经常出现外源基因表达量低的问题，因此针对这一问题，本实验室根据植物偏爱密码子［8-10］人工设计合成纳豆激酶基因（GenBank登录号：KJ495732），并在其ORF第519和第520个碱基之间插入番茄果实特异表达基因E8的第一内含子（GenBank登录号：X13437.1），分别构建了植物双元表达载体pPZP221（35s-sNK-nos）和pPZP221（35s-sNK-E8i-nos），通过根癌农杆菌介导的转化方法，分别将人工合成的纳豆激酶基因sNK和插入番茄果实特异表达基因E8第一内含子的纳豆激酶基因sNK-E8i转化到模式植物烟草中，并对转基因植株中纳豆激酶基因表达及酶活性进行测定，以期提高纳豆激酶在烟叶中的表达水平。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 烟草（Nicotiana tabacum L.）品种NC89原种，由中国农业科学院烟草研究所贾兴华研究员提供。

1.1.2 菌种和质粒 pPZP221（35s-nos）质粒、农杆菌LBA4404均为本实验室保存。以植物偏爱密码子进行序列优化的纳豆激酶全长基因sNK、在sNK中间插入番茄果实特异表达基因E8的第一内含子的纳豆激酶基因sNK-E8i及其植物表达载体pPZP221（35s-sNK-nos）、pPZP221（35s-sNK-E8i-nos）由本实验室构建。

1.1.3 培养基 萌发培养基：MS+0.7% 琼脂粉；芽诱导（共）培养基（YN）：MS+0.1 mg/L IAA+1 mg/L 6-BA+0.7% 琼脂粉；选择培养基（YN++）：MS+0.2 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA+40 mg/L庆 大 霉 素（Gen）+200 mg/L头孢霉素（Cef）+0.7% 琼脂粉；生根培养 基（GN++）：MS+0.5 mg/L IAA+40 mg/L Gen+100 mg/L Cef+0.7% 琼脂粉。

1.2 方法

1.2.1 无菌苗的培养 用70%的无水乙醇处理种子1 min后，放入1%的NaClO中浸泡10 min，用无菌水冲洗5-6次后接种于萌发培养基上。

1.2.2 转化菌的活化及扩培 将含有pPZP221（35s-sNK-nos）和pPZP221（35s-sNK-E8i-nos）的农杆菌LBA4404分别接种于含100 mg/L利福平（Rif）+100 mg/L壮观霉素（Spec）的YEB固体培养基上，28℃划线培养48 h；挑取单菌落于含有相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃ 180 r/min振荡培养24 h；至OD600=0.3-0.4时，取2 mL活化菌接种到50 mL相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃180 r/min培养5-8 h；取出菌液，5 000 r/min离心10 min，弃去YEB上清液；用10 mL 0.01 mol/L的MgSO4悬浮菌体，5 000 r/min离心10 min，弃上清，收集菌体；用不含蔗糖的MS液体培养基稀释至OD600=0.3-0.4，即可用于转化。

1.2.3 农杆菌侵染烟草叶盘外植体 取无菌苗幼叶，切成0.5 cm2的外植体，叶背朝上，放置于YN培养基上；2 d后将其放入制备好的菌液中侵染20 min；将侵染后的外植体接种在YN培养基上，25℃共培养2 d；无菌水冲洗2次后放入含Cef 250 mg/L的无菌水中浸泡10 min，将外植体于无菌滤纸上吸干水分，接种于YN++培养基上，叶背向上，25℃黑暗条件下培养10 d后，16 h/8 h明暗交替光照培养，

待芽长到2 cm时转入GN++培养基。

1.2.4 转基因烟草植株鉴定 采用SDS法提取烟草植株总DNA，设计sNK基因特异性引物sNK-F/R（表1）进行PCR特异性扩增。PCR反应体系为25 μL，包含模板100 ng，引物sNK-F/R（5 μmol/L）各2 μL，4×dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，10×PCR反应缓冲液2.5 μL，rTaq酶（5 U/μL）0.125 μL，灭菌水补足25 μL。反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环；72℃保温5 min。反应完毕后取10 μL PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳检测。

表1 引物序列

1.2.5 转基因烟草植株纳豆激酶基因表达量检测用TaKaRa RNA提取试剂盒提取PCR阳性烟草植株总RNA。用TaKaRa反转录试剂盒反转录合成cDNA：以500 ng总RNA为模板，加入2 μL试剂盒中所带有的5×PrimeScript RT Master Mix，再加RNase Free dH2O至10 μL；混匀后，进行反转录反应。反应条件为：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 10 min。

以cDNA为模板，进行RT-PCR，引物、预期产物长度、反应体系及反应条件与鉴定转基因植株PCR检测相同。

1.2.6 sNK与sNK-E8i 基因在烟草中表达量的比较 以cDNA为模板，随机选取RT-PCR呈阳性的转sNK烟草植株和转sNK-E8i烟草植株各3株，以Actin 基因作为定量的内参基因，以sNKQ-F/R为目的基因引物，用TaKaRa 公司SYBR Premix Ex TaqII染料法荧光定量试剂盒进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR），每个处理均重复3次，H2O为空白对照。反应体系为 25 μL，包含12.5 μL 2× SYBR® Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）溶液、正向和反向引物各加入1 μL（5 μmol/L）、1 μL cDNA（50 ng/μL）和9.5 μL 灭菌双蒸水。反应条件为：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环；4℃ 10 min。

1.2.7 转基因烟草植株纳豆激酶酶活检测 根据Astrup等［11］报道的方法，以纤维蛋白原、凝血酶为原料，经过改良，用巴比妥那-盐酸缓冲液制作纤维蛋白平板。以尿激酶为标准品，制作标准曲线，将尿激酶用生理盐水稀释为1、2、3、4、5、6、7和8 U/mL，每个浓度取10 μL点在已制备好的琼脂糖-纤维蛋白平板上，每个浓度做3个重复，加平皿盖正置于37℃，保温20 h。测量溶圈直径，计算溶圈面积，重复测量3次，求得平均值。以测定的溶圈面积对标准品不同酶活力作标准曲线，得回归方程和相关系数。取PCR及RT-PCR检测均为阳性的烟草植株，用PBS法［12］粗提烟草叶片总蛋白；取烟草蛋白粗提液10 μL点在纤维蛋白平板上后，置于37℃培养箱，20 h后，根据溶圈的面积同标准曲线相比测定酶活力。

1.2.8 转基因烟草植株的加代培养 由于本试验所用的表达载体为pPZP221，其上带有Gen植物抗性基因标记，可对Gen产生抗性，因此我们选取Gen对转纳豆激酶基因烟草NC89 T0代种子进行抗生素筛选。首先对筛选培养基中抗生素的浓度进行确定，将野生型烟草NC89种子分别接种在Gen浓度为100、200、300和400 mg/L的筛选培养基上光照培养，每个梯度处理接种30个种子，3组重复，20 d后观察出芽率及正常植株所占比例，选取最适浓度范围，然后用相同的方式缩小梯度范围，最终确定筛选培养基中抗生素的最适浓度。随后，将转纳豆激酶基因烟草NC89 T0代种子接种于筛选培养基上，30 d后长出的苗子转到MS基本培养基上，待烟叶量足够时，提取烟草总DNA，以sNK-F/R引物对其进行PCR检测，得到的阳性苗进行扦插扩繁移栽组培室。

2 结果

2.1 转基因烟草植株的获得

用 含 质 粒pPZP221（35s-sNK-nos），pPZP221（35s-sNK-E8i-nos）的根癌农杆菌LBA4404分别侵染烟草品种NC89的幼叶切片，侵染后的烟草叶片经共培养、脱菌处理后，置于选择培养基上，约20 d后，外植体周围出现愈伤组织并有绿色芽点形成。45 d

左右时，待芽长到2 cm时，切下幼芽转入生根培养基，其后约1个月左右生根成苗（图1）。以含目的基因的质粒pUC57-sNK为阳性对照，野生型植株叶片总DNA为阴性对照，H2O为空白对照，以sNK基因特异性引物进行PCR检测，结果显示，有12株转sNK基因烟草植株和10株转sNK-E8i基因烟草植株总DNA扩增产物与阳性质粒一致，两者PCR产物相同，均为484 bp的特异性条带（图2），初步证明目的基因已整合到烟草基因组中。得到的阳性植株，进行扦插扩繁，移栽至花盆中，组培室室内培养。

图 1 组织培养各阶段

图 2 转sNK基因、sNK-E8i基因烟草植株的PCR检测

2.2 RT-PCR检测

取PCR检测呈阳性的烟草植株叶片，提取叶片总RNA，反转录为cDNA后，进行RT-PCR。结果（图3）显示，有9株转sNK基因烟草植株（T01-T09）和10株转sNK-E8i基因烟草植株（T010-T019）扩增产物与阳性质粒一致，表明其在转录水平上有纳豆激酶基因的表达。

图3 转sNK基因、sNK-E8i基因烟草植株的RT-PCR检测

2.3 RT-qPCR

随机选取RT-PCR呈阳性的转sNK基因烟草植株（T01、T04和T09）和转sNK-E8i基因烟草植株（T010、T013和T015）各3株，进行RT-qPCR，对比其表达量。图4显示，转sNK-E8i基因的植株中纳豆激酶的表达量比转sNK基因的植株中高。进行统计学分析表明P＜0.05，两者之间存在显著性差异。

图4 sNK 基因与sNK-E8i基因在烟草中相对表达量

2.4 转基因烟草植株纳豆激酶酶活检测

根据尿激酶标准品纤溶性（图5）制作标准曲线，结果（图6）显示，R2=0.983 8，说明尿激酶酶活力与溶圈面积具有较高的线性相关性。取RT-PCR

呈阳性的30 d龄烟草植株叶片0.1 g，用200 μL PBS缓冲液提取叶片总蛋白，用纤维蛋白平板法检测酶活性。结果（图7）显示，有5株转sNK基因烟草植株（T01、T02、T05、T07和T09）和3株转sNKE8i基因烟草植株（T011、T012和T013）检测到溶圈，分别占所检测植株的56%和30%。根据溶圈的面积同标准曲线相比测定酶活力，结果如表2所示。

图 5 尿激酶标准品纤溶活性

图 6 尿激酶酶活标准曲线

图7 转基因植株纤溶活性测定

表2 纤维蛋白平板法测得酶活

2.5 转纳豆激酶烟草植株的加代培养

2.5.1 烟草NC89 Gen本底抗性水平测定试验 表3显示，当培养基Gen浓度高于100 mg/L时，出芽率明显降低，且正常苗比例极低。因此，选取0-100 mg/L Gen浓度范围内，以10 mg/L为一个梯度，再次以同样的方式进行筛选，最终确定筛选培养基中Gen浓度为50 mg/L（表4）。

2.5.2 T1代转sNK、sNK-E8i基因烟草植株的获得取T01、T02、T05、T07、T09、T011、T012和T013植株的种子各50粒，经无菌处理后，分别接种于Gen筛选培养基上，对得到的抗性植株进行PCR检测，获得了T1代转基因烟草植株。

3 讨论

自1986年，Barta等［13］首次利用植物表达系统成功生产人生长激素后，由于利用转基因植物生产药用蛋白具有经济、安全、副作用小、有些植物材料可直接食用等优点，日益成为国际上植物基因工程的一个新的发展趋势。而利用植物生物反应器生产药用蛋白往往会面临外源基因表达量低的问题。影响外源蛋白在植物中表达的因素有很多，如表达系统的选择、启动子的选择、mRNA的稳定性、转录和表达的效率等。因此，我们选择从密码子改造和插入内含子两方面对纳豆激酶基因进行优化。植

物中遗传密码子的使用频率与动物、微生物不同，适当地将外源基因的密码子替换成为植物偏爱的密码子，能显著提高该基因在植物中的表达水平。而根据文献报道，内含子在增加mRNA的稳定性和增加基因表达量方面起到正调节作用［14-16］。

表3 不同质量浓度Gen对烟草植株生长的影响

表4 低质量浓度Gen对烟草植株生长的影响

本研究将人工合成的纳豆激酶基因sNK和sNKE8i转化到模式植物烟草中，共得到了22株含有目的基因的T0代转基因烟草植株。RT-PCR结果显示，构建的两个基因均在mRNA水平上有表达，表明我们所合成的基因可在植物中正常转录。并且由RT-qPCR结果可知，转sNK-E8i基因的植株中纳豆激酶的表达量比转sNK基因的植株中高。由于本研究构建的两个植物表达载体除E8内含子外没有任何差异，农杆菌侵染的受体材料完全相同，纳豆激酶表达量的提高应该是由于E8内含子介导的增强效应的结果，说明内含子在克服植物生物反应器中外源基因表达量低［17-20］的问题中可以起到增强子的作用。另外，纤维蛋白平板法测定酶活试验结果证明，本研究已获得有纳豆激酶活性的转sNK基因和转sNKE8i基因 T0代烟草转基因植株，证明以烟草为生物反应器生产纳豆激酶是可行的。为下一步得到稳定遗传的纯合植株，我们通过Gen筛选和PCR鉴定，进行了加代得到了T1代转基因烟草植株。

4 结论

根据植物偏爱密码子人工合成的纳豆激酶基因和其中插入番茄果实特异表达基因E8第一内含子的纳豆激酶基因在转基因烟草中可表现出较高活性，经加代培养已得到T1代转化基因植株。

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（责任编辑 马鑫）

Research of Transferred Synthetic Nattokinase Gene in Tobacco Genome

Liu Jinglei Zhang Yan Sun Xiaolei Han Lan Kh.Mandakhtsetsen Hasi Agula
（Inner Mongolia Key Laboratory of Herbage ＆ Endemic Crop Biotechnology，College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Huhhot 010021）

The nattokinase gene sNK which was artificially synthesized according to plant preferential codons, and the nattokinase gene sNK-E8i which has been got by inserting the first intron of tomato specifically expressed gene E8 into sNK, were transformed into tobacco NC89 through Agrobacterium-mediated method. 12 strains of sNK transgenic tobacco plants and 10 strains of sNK-E8i transgenic tobacco plants were acquired through PCR test. It preliminarily demonstrated that the target genes were integrated into tobacco genomes. It was found that 9 strains of sNK transgenic tobacco plants and 10 strains of sNK-E8i transgenic tobacco plants were positive by using RT-PCR. The result showed that the expression level of sNK-E8i transgenic tobacco plants was higher compared with that of sNK transgenic tobacco plants by RT-qPCR. Besides, the enzyme activity was tested through agarose-fibrin plate analysis, and the dissolving circles of 5 strains of sNK transgenic tobacco plants and 3 strains of sNK-E8i transgenic tobacco plants were detected. The result showed that target genes could be transcribed and translated normally in a part of transgenic tobacco and presented the activity of thrombolysis. The T1transgenic straints were obtained by generation-adding cultivation.

Nattokinase Synthetic Plant preferential codon Tobacco Agarose-fibrin plate analysis

2014-03-03

内蒙古自治区“草原英才”工程资助项目（内组通字［2013］17号）

刘靓蕾，女，硕士，研究方向：植物分子生物学及基因工程；E-mail：472304231@qq.com

哈斯阿古拉，男，博士，教授，研究方向：植物分子生物学及基因工程；E-mail：hasind@sina.com