分蘖洋葱查尔酮异构酶基因的克隆及表达载体的构建

刘丹 吴凤芝

（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

分蘖洋葱查尔酮异构酶基因的克隆及表达载体的构建

刘丹 吴凤芝

（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

旨在得到分蘖洋葱查尔酮异构酶基因，探明该基因的功能。克隆查尔酮异构酶基因并构建了其超表达和干扰载体，以期得到用于研究查尔酮异构酶基因功能的表达载体。从分蘖洋葱叶片中克隆得到查尔酮异构酶基因cDNA 全长743 bp，GenBank登录号为KJ489062。结果显示，该基因633 bp的开放读码框编码210个氨基酸的多肽序列。将PCR 扩增克隆得到的分蘖洋葱查尔酮异构酶基因片段连接到干扰载体pCAMBIA1301和超表达载体SOL2095中，成功构建了35S 启动子控制的植物表达双元载体pCAMBIA1301-CHI和SOL2095-CHI。

分蘖洋葱 查尔酮异构酶 基因克隆 载体构建

黄酮类化合物是多酚类次生代谢物质，由苯丙烷代谢途径合成。黄酮类化合物具有很多重要功能，如紫外防护、抗病原微生物、参与花色形成、植物的育性及植物与微生物相互识别协作等。查尔酮异构酶（Chalcone isomerase，CHI）也称查尔酮黄酮异构酶（Chalcone flavanone isomerase）［1］，是类黄酮物质合成的关键酶之一［2］，可催化分子内环化反应，使双环的查尔酮转化为有生物学活性的三环（2S）-黄烷酮。CHI 蛋白以单体的形式普遍存在于大多数植物中，分子量因植物组织而异，约24-29 kD［3］。目前，查尔酮异构酶基因在几种植物中已被克隆：如雪莲［4］、矮牵牛［5］、紫花苜蓿［6］、百合［7］、水稻［8］、马铃薯［9］等。CHI 基因表达量的高低不仅对花色影响大，同时也会影响到黄酮类代谢产物的合成。

分蘖洋葱（Allium cepa var. agrogatum Don.）俗称毛葱，为百合科葱属草本植物。其适应性强，高产、耐贮、供应期长，是黑龙江省传统的优良农家品种，在广大农村多有种植。其鳞茎中含有特殊辛辣味的挥发性硫化物，具有杀菌消毒作用，亦是类黄酮含量较高的蔬菜种类之一，生产中常被用于间、混、套作，用来减轻连作障碍问题［10］。近年来的研究表明，基因表达产物可通过根系分泌物进入土壤中，进而对土壤生态系统产生影响［11］。本研究利用基因手段调控查尔酮异构酶的表达，验证其对土壤微生物群落和多样性的影响，克隆分蘖洋葱查尔酮异构酶基因，进行序列分析，确定该酶的功能相关

结构域，并分别构建该基因的过表达载体和RNAi表达载体，旨在为进一步探索CHI 基因在分蘖洋葱中的功能，以及在转基因植物中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料分蘖洋葱来源于黑龙江省五常市红七社村。农杆菌EHA105、GV3101，植物表达载体包括超表达载体pDONR207、SOL2095，干扰载体pBluescript SK、pCAMBIA1301由本实验室保存。大肠杆菌DH5α、载体pMD18-T购自大连宝生物公司。试验于2013年3月-11月在东北农业大学园艺学院完成。

1.2 方法

1.2.1 3'RACE的扩增 以Trizol法提取分蘖洋葱叶片总RNA，根据本实验室建立的分蘖洋葱转录组的测序结果，在开放阅读框设计3'引物。FACE1：5'-AGTTTGGCCTGCAAGTAGGATC-3'；FACE 2：5'-GGACAGATTAGTCTCCTATGAC-3'分别与通用引物5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'进行巢式PCR的扩增获得3'序列。PCR程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 40 s，35 个循环；72℃10 min。扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，用凝胶成像分析系统进行拍照及分析。扩增产物按照BioTeke公司的凝胶回收试剂盒的使用说明进行回收。回收目的片段连接到TaKaRa公司pMD18-T载体。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，进行阳性克隆筛选。阳性克隆由上海生物工程有限公司进行序列测定。

1.2.2 生物信息学分析 将克隆基因测序结果提交NCBI 进行BLAST 检索，确认克隆得到了查尔酮异构酶基因。蛋白功能结构域、电荷、分子量、等电点等预测分别使用ExPASy蛋白质组分析工具（http：//www.expasy.ch/tools/）中的ProtParam（http：// web.expasy.org/protparam/）和NCBI软件进行分析。

1.2.3 基因的克隆

1.2.3.1 CHI基因cDNA全长的克隆 根据Gateway克隆技术设计CHI全长的引物序列，attB1-CHI-F：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGG AGTCGAAGATGATC-3'；attB1-CHI-R：5'-GGGGACC ACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAGCGTCCGATAAC ATTAATC-3'（下划线为Gateway的接头序列）。采用Platinum Pfu DNA 聚合酶，反应条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 50 s，35个循环；72℃10 min。琼脂糖凝胶电泳检测产物，进行纯化回收。

1.2.3.2 CHI 基因 RNAi 片段的克隆 以Trizol法提取分蘖洋葱叶片总RNA，使用天根公司的M-MLV反转录获得cDNA 第一链。逆转录试剂盒根据生物信息学分析结果设计 RNAi 引物序列。

CHI-RNAiZ-AttB1-fw：5'-GCTCTAGACGATGCTATTGTGTCTGCTGA-3'（下划线为Xba I 位点）；CHIRNAiZ-AttB2-nostop-rev：5'-CGGGATCCTCCACCCATGTACCATTTCTGT-3'（下划线为BamH I 位点）。

CHI-RNAiF-AttB1-fw：5'-CCGGGTACCGATGCT ATTGTGTCTGCTGA-3'（下划线为Kpn I 位点）；CHIRNAiF-AttB2-nostop-rev：5'-ACGCGTCGACTCCACCC ATGTACCATTTCTGT-3'（下划线为Sal I 位点）。

PCR反应条件为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃40 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 10 min。用琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，进行纯化回收。

1.2.4 表达载体的构建

1.2.4.1 利用Gateway技术构建超表达载体

（1）入门载体的构建：BP反应创建Entry载体pDONR207：用回收纯化后的带有接头的PCR产物与受体载体pDONR207进行重组反应。BP反应体系中包括PCR 产物50-150 ng、pDONR207载体1 μL、5×BP ClonaseTM反应缓冲液2 μL、BP ClonaseTM酶混合物1 μL，补充TE 缓冲液（pH8.0）至10 μL。反应体系置25℃温育2 h后加入2 μL蛋白酶K溶液，37℃温育10 min 以终止BP反应。将反应产物转化至50 μL E.coli DH5α感受态细胞中。转化后涂布含50 mg/L卡那霉素的LB筛选培养基，37℃培养过夜。挑取单菌落至5 mL含50 mg/L卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜。

（2）LR反应：LR反应的目的在于将已经重组入Entry载体的目标基因再克隆到表达载体SOL2095，以产生表达克隆。LR反应体系中包括Entry克隆100-300 ng、SOL2095载体1 μL、5×LR ClonaseTM反应缓冲液2 μL、LR ClonaseTM酶混合物1 μL，补充TE 缓冲液（pH8.0）至10 μL。反应体系

置25℃温育2 h后加入2 μL蛋白酶K溶液，37℃温育10 min以终止LR反应，载体构建，见图1。

图1 SOL2095-CHI 载体构建图

（3）LR反应产物的转化及阳性克隆的鉴定：将LR反应产物转化大肠杆菌菌株DH5α，提取质粒。对重组质粒进行PCR和测序鉴定，以确定是否构建到超表达载体中。

1.2.4.2 RNAi 载体的构建 从分蘖洋葱扩增出CHI保守区上的337 bp片段，正向片段连 pMD18-T并测序正确后用Xba I和BamH I双酶切后连入pBluescript SK载体上，进行测序和酶切验证。酶切验证后与连有反向片段的pMD18-T载体分别进行Sal I和Kpn I双酶切，将反向片段回收后连接到同样酶切的pBluescript SK-F质粒上。

当CHI-R反向片段连到上述的pBluescript SK-F重组质粒上时，对上述重组质粒用Xba I和Kpn I进行双酶切，切下pBluescript SK-FR目的片段，连到经同样双酶切的1301质粒上，构建成重组质粒pCAMBIA1301-FR，并用Xba I和Kpn I双酶切鉴定CHI-FR是否连到pCAMBIA1301重组质粒上，载体构建如图2所示。

2 结果

2.1 分蘖洋葱查尔酮异构酶基因及序列分析

3' RACE 方法扩增后得到CHI基因大小约 500 bp左右的3'端的目的片段（图3）。测序后与前期已获得的片段序列进行拼接，获得了CHI 基因的全长cDNA序列（图4）。通过对序列中起始、终止密码子以及各可能的ORF比较，该序列大小为743 bp（GenBank登录号KJ489062），其中包括ATG起始密码子、TAA 终止密码子。开放读码框共633个碱基，编码210个蛋白。经NCBI查询，该基因与荷兰鸢尾（Iris×hollandica，GenBank登录号KJ192336.1）、石斛兰（Dendrobium，GenBank登录号KC345013.1）、花生（Arachis hypogaea，GenBank登 录 号JN412735）、 金 银 花（Lonicera japonica，GenBank登录号JX068610.1）具有较高的同源性，分别为79%、78%、76%和75%，因此可认定获得的基因为CHI，将其命名为AcadCHI。

2.2 AcadCHI 预测蛋白的生物信息学分析

分蘖洋葱CHI 基因的开放阅读框为1-633 bp区域，编码一条含210个氨基酸的蛋白质。软件在线分析显示多肽分子量为23.7582 kD，等电点pI值为4.86，原子总数为3 358，分子式为C1068H1689N267O325S9，不稳定系数为38.47，为稳定性蛋白。将分蘖洋葱CHI氨基酸序列输入到NCBI网站中分析，结果（图5）表明，在其第1-210位氨基酸构成一个结构域，高度保守结构域为第115-132位氨基酸。

图2 pCAMBIA1301-CHI 载体构建图

2.3 分蘖洋葱AcadCHI基因超表达载体的构建

将利用Gateway技术构建的超表达载体，测序结果（图6）显示，带有B序列接头的AcadCHI全长基因的序列进行测序PCR反应，对反应产物进行纯化后，结果（图6）显示，AcadCHI全长基因两端

已经加入了B序列接头，并且读码框正确，未发生 移码现象，说明超表达载体构建正确。

图5 AcadCHI蛋白结构功能域的分析

图6 含B序列接头的AcadCHI 的核苷酸序列

2.4 分蘖洋葱AcadCHI基因干扰片段的克隆及载体构建

2.4.1 正、反义片段的克隆及重组子的鉴定 以反转录获得的cDNA第一链为模板，分别进行正向、反向插入片段扩增，扩增产物长度均为337 bp（图7，图8）。重组质粒pMD-F和pMD-R分别用Xba I /BamH I及Sal I /Kpn I双酶切，均可切下337 bp的目的片段（图9），且测序结果正确，说明载体pMD-F和pMD-R构建成功。

图7 AcadCHI-F的扩增

图8 AcadCHI-R的扩增

2.4.2 pBluescript SK-F及pBluescript SK-FR质粒重组子鉴定 重组质粒pBluescript SK-F用Xba I/BamH I双酶切，在337 bp处得到目的条带（图10），表明pKA-F载体已构建成功。重组质粒pBluescript SK-FR分别用Sal I /Kpn I双酶切（图11），337 bp处有目的条带，表明pBluescript SK-FR载体构建成功。

2.4.3 pCAMBIA1301-RNAi-CHI质粒重组子的鉴定 重组质粒pBluescript SK-FR用Xba I /Kpn I双酶切，在957 bp左右处得到目的条带（图12），说明

载体构建成功，将酶切的片段和pCAMBIA1301载体用Xba I /Kpn I双酶切得到的片段进行连接，构建得到载体pCAMBIA1301-RNAi-CHI。

图9 pMD-F和pMD-R酶切鉴定

图10 pBluescript SK-F酶切鉴定

图11 pBluescript SK-FR酶切鉴定

将重组质粒用Xba I/Kpn I进行双酶切得到957 bp左右的目的条带（图13），表明RNAi 载体pCAMBIA1301-RNAi-CHI已经构建成功。

3 讨论

查尔酮异构酶是黄酮类化合物代谢途径的一个关键酶，因此，近年来该酶也成为黄酮代谢调控工程研究的一个热点酶。Muir等［12］发现查尔酮异构酶（Chalcone isomerase，CHI）是黄酮类代谢途径中的早期酶，也是增加黄酮醇产物的关键酶。本研究首次从分蘖洋葱通过 RT-PCR法克隆得到cDNA，全长约743 bp。该基因编码210个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，是一个完整的CDS，GenBank登录号为KJ489062，多肽分子量为23.7582 kD，等电点pI值为4.86。这与已登录的大部分常见物种的CHI大小基本一致，该基因与荷兰鸢尾、石斛兰、花生和金银花具有较高的同源性，分别为79%、78%、76%和75%，确定为查尔酮异构酶基因。

图12 pBluescript SK-FR 酶切鉴定

图13 pCAMBIA1301-CHI-FR 酶切鉴定

Gateway克隆技术克服了传统的酶切和连接方法构建载体的种种缺陷，能够将基因高效地克隆到一个或多个与Gateway克隆技术兼容的载体系统中［13］，利用Gateway技术构建的载体具有高拷贝数的复制起点，可以满足大规模的克隆操作的需求［14］。RNAi 技术因其具有高效特异和操作简便的特点已经成为基因功能研究中一项有力的工具，以其高度专一性和有效的干扰特性使特定基因沉默，获得功能丧失或降低的突变体，此技术已广泛应用到水稻［15］、拟南芥［16］等的载体构建中。本研究成功构建了控制植物表达的干扰载体pCAMBIA1301-CHI和超表达

载体SOL2095-CHI。首次克隆百合科葱属植物分蘖洋葱的CHI基因并构建了其表达载体。通过两种载体的成功构建，可以直接用于农杆菌介导的植物转化，并为下一步试验奠定了基础。

目前对CHI基因的研究很多，主要运用在外源CHI基因的表达来提高黄酮类物质［4，5］、改变花色［17］等研究上，利用基因手段调控查尔酮异构酶的表达，改变植物土壤微生物多样性的研究还鲜有报道。本研究应用RACE 法克隆了CHI基因，构建了35S启动子驱动的CHI 基因的超表达和干扰两个组成型表达载体，下一步会将CHI基因转化到植物中进行表达和功能鉴定，期望能为实际生产提供理论依据。

4 结论

从分蘖洋葱叶片中克隆得到查尔酮异构酶基因cDNA全长743 bp，GenBank登录号KJ489062。经分析发现该基因633 bp 的开放读码框编码210个氨基酸的多肽序列。将PCR扩增得到的分蘖洋葱查尔酮异构酶基因片段连接到表达载体中，成功构建了35S 启动子控制的植物表达双元载体pCAMBIA1301-CHI干扰载体和SOL2095-CHI超表达载体。

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（责任编辑 马鑫）

Cloning of Chalcone Isomerase Gene from Potato Onion and Plant Expression Vector Construction

Liu Dan Wu Fengzhi
（Horticulture College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

To clone and analyse the function of the potato onion chalcone isomerase gene, we generated CHI over-expression construct and RNAi construct. Full-length CHI gene is 743 bp, and the GenBank accession number is KJ489062. Results showed that, CHI gene open reading frame contain 633 bp, translating into 210 amino acids. Full-length CHI gene and the fragment of CHI gene for silencing were amplified by PCR on complementary DNA（cDNA）, then PCR fragment was transferred to the binary vector under the control of 35S.

Potato onion Chalcone isomerase Gene cloning Vetor construction

2014-04-28

国家自然科学基金项目（31172002）

刘丹，女，博士研究生，研究方向：植物分子生物学；E-mail：mdjliudan@126.com

吴凤芝，女，博士，教授，研究方向：设施园艺与蔬菜生理生态；E-mail：fzwu2006@aliyun.com