bar基因表达蛋白单克隆抗体制备及ELISA 检测方法的建立

龙丽坤 李葱葱 张明 李飞武

（吉林省农业科学院，长春 130033）

bar基因表达蛋白单克隆抗体制备及ELISA 检测方法的建立

龙丽坤 李葱葱 张明 李飞武

（吉林省农业科学院，长春 130033）

通过原核表达诱导bar基因表达蛋白，通过表达蛋白免疫BALB/c 小鼠，经细胞融合、筛选克隆，获得一个杂交瘤细胞株。以兔多抗作为捕获抗体，鼠单抗作为示踪抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 作为检测系统，建立了转基因植物bar基因检测双抗夹心ELISA 方法，试验证明利用该抗体建立的ELISA检测方法含有转bar基因的转基因玉米成分具较好的特异性和灵敏度。为转基因成分的检测提供了安全、快速、准确的技术手段。

bar基因 杂交瘤细胞 单克隆抗体 转基因检测

随着转基因技术的不断发展，人们对于转基因生物及其产品的安全性的关注度越来越高，为此，包括我国在内的50多个国家和地区建立了标识制度，对转基因产品实行严格监管。标识监管制度的实施，依赖于快速、灵敏、准确的检测方法。目前转基因产品检测技术主要分为两大类，一类以外源DNA为检测对象，如PCR、LAMP等；另一类以外源基因表达蛋白质为检测对象，如ELISA、快速检测试纸条等［1］。

转基因外源蛋白检测方法是以纯度好、效价高的蛋白抗体与抗原蛋白的特异性结合为基础。目前转基因品种中外源蛋白抗体的制备和方法应用，针对Cry1Ab、Cry1Ac等Bt蛋白，CP4-EPSPS蛋白，磷酸酶II等蛋白的检测方法已广泛应用［2］。bar基因，编码蛋白—膦丝菌素乙酰转移酶（PAT），该基因广泛应用于基因工程育种中，也是遗传转化中的标记基因，它使植物抵抗以L-phosphiothricin（PPT）为活性成分的除草剂［3］。随着转基因食品的快速发展，国外转bar基因作物和食品大量进入我国，转bar基因的食品检测技术是转基因食品安全性评价的重要组成部分，其技术研究具有重要的意义。目前，国内对于bar基因表达PAT蛋白的检测研究相对较少［4］。研究者多利用多克隆抗体进行检测方法研究，但多克隆抗体制备相对复杂，产量较低，抗体稳定

性和检测重复性具有一定局限性。高旭东等［5］的研究仅制备了表达PAT蛋白单克隆抗体的细胞株，如用于酶联免疫检测方法仍有待于对抗体特异性和效价进行进一步验证。

本研究针对检测Bar蛋白作为转基因作物或食品常用筛选方法，制备了高效PAT蛋白单克隆抗体，旨为利用联免疫技术快速检测植物、食品耐抗除草剂转基因成分提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体和细胞 pET-28a载体载体E. coli DH5α、BL21感受态细胞，鼠源肾细胞，SP2/0 骨髓瘤细胞均购自上海生工生物技术公司。

1.1.2 试验动物 BALB/c 雌性小鼠由北京鼎国生物公司提供。

1.1.3 转基因标准样品 转基因玉米及其成分含量样品，由农业部转基因环境安全监督检验测试中心（长春）制备并提供。

1.1.4 主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、反转录酶、LA Taq DNA 聚合酶均购自TaKaRa 公司；pMAL 融合蛋白表达与纯化试剂盒购自NEB 公司；蛋白Marker 购自Fermentas 公司；弗氏佐剂、PEG、HAT、HT、8-氮鸟嘌呤（8-AG）、邻苯二胺（OPD）均购自Sigma 公司；HRP 标记羊抗鼠IgG（HRPIgG）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；SBA ClonotypingTMSystem/HRP 抗体亚类鉴定试剂盒购自Southern Biotechnology 公司；二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 从数据库中检索商业化载体序列，进行核苷酸和氨基酸序列比对。对核酸序列进行密码子优化，使其更适于大肠杆菌中表达，并保证氨基酸序列不变。序列确定后，5'端引入BamH I酶切位点，3'端引入Hind III酶切位点，最终设计并确定扩增bar基因全长的引物序列为：BarF：5'-CGCGGATCCATGTCTCCG-3' BarR：5'-CCCAAGCTTGATTTCGGTAAC-3' 扩增长度为：567 bp。

1.2.2 基因扩增和表达 以合成引物序列扩增bar基因全长，用BamH I和Hind III内切酶分别酶切pET-28a载体，并将扩增片段连接入pET-28a载体，连接产物转化至DH5α感受态细胞；利用PCR扩增鉴定阳性质粒，并将阳性重组质粒命名为pET-Bar。提取质粒pET-Bar并转化到BL21（DE3）感受态细胞。筛选阳性克隆。挑取含pET-Bar质粒的单克隆菌落，接种于100 mL含有氨苄青霉素的 LB培养基（用LB（Amp+）表示）中，37℃震荡培养过夜。次日用LB（Amp+）稀释至1 000 mL，37℃培养至OD600=1左右，加IPTG至终浓度为1 mol/L。37℃继续培养6 h。4℃，5 000 r/min离心10 min，收集沉淀并用PBS洗涤。

1.2.3 原核抗原蛋白分离 灌制10%分离胶60 mL和5%浓缩胶15 mL，灌胶。上样后进行SDS-PAGE凝胶电泳。电压100 V，电泳6-7 h。终止电泳后，用冷0.1 mol/L KCl浸泡胶 2-3 min，切下目的条带置透析袋内。将透析袋置于水平电泳洗脱装置内，60 V 洗脱过夜。次日100 V继续洗脱1 h。反转电极向相反方向洗脱3-5 min。吸出透析带内液体，蔗糖包埋浓缩，PBS透析。

1.2.4 动物免疫、细胞融合、筛选、克隆及MAb 制备 用纯化后的Bar蛋白免疫6 周龄雌性BALB/c 小鼠，利用间接ELISA 筛选方法对上清进行检测，具体参照文献［6，7］方法进行。采用液相有限稀释法进行细胞克隆。

取20-22 g Balb/c雌性小鼠，每只腹腔注射0.5 mL降殖烷（2，6，10，14- Tetramethylpen- tradecane，Janssen Chimica公司）。一周后，每只小鼠腹腔注射约2×106个杂交瘤细胞。7-10 d后小鼠腹部显著膨隆，收集腹水。

1.2.5 MAb 亚类测定 按照SBA ClonotypingTMSystem/HRP 抗体亚类试剂盒说明书进行检测。

1.2.6 ELISA检测方法的建立 方阵试验确定兔抗bar基因蛋白多抗与McAb 最佳工作浓度［8，9］。以兔抗bar基因 IgG包被液和单抗稀释液浓度梯度，按照多抗包被-封闭-加样-加单抗-加二抗-显色与终止的程序进行。在酶标仪上读取OD450nm。以阳性孔OD 值接近1，P/N 值最大时，确定兔抗PPV IgG 和McAb 的最大稀释度为其最佳工作浓度。以确定的最佳单抗和多抗浓度作为ELISA检测体系的关键参数，进行样品检测。

2 结果

2.1 PAT蛋白抗原表达与分离

利用设计的引物，进行优化密码子的bar基因全序列扩增，扩增条件为95℃，5 min；95℃30 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸10 min，扩增的片段经2% 琼脂糖凝胶电泳，检测为567 bp特异性片段，见图1。并经过测序鉴定，验证了与设计片段序列的一致性。

图1 bar基因全长的扩增图谱

获得的567 bp的bar基因片段克隆至pET-28a载体，表达载体在IPTG诱导6 h后能稳定表达PAT融合蛋白。融合蛋白以包涵体形式存在，约占菌体总蛋白的10%。其分子量约为27 kD（图2）。获得的纯化的PAT蛋白为本试验所用抗原。

2.2 杂交瘤细胞筛选和单克隆抗体的纯化

每只小鼠200 μg Bar蛋白腹腔注射，第3次免疫1周后，进行第4次免疫，用酒精棉球消毒小白鼠尾部，把吸取的0.1 mL溶于PBS的PAT蛋白，注射入小白鼠尾部静脉。

免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/O融合并进行杂交瘤细胞筛选；按照文献方法进行，克隆采用有限稀释法进行，准确计数后进行系列稀释到1 mL含10个细胞，克隆后，选取单个细胞生长集落孔上清进行检测，从中选取1个阳性值最高的孔再进行克隆，直至检测阳性率为100%。本研究获得了1株能稳定分泌抗PAT蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞株命名为4C2，于2012年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6341。

2.3 单克隆抗体的纯化

小鼠腹腔注射约2×106个杂交瘤细胞。收集腹水。12 000 r/min离心30 s，去除沉淀和上层油脂，收集中段液体。并用PBS透析。平衡Protein A Sepharose-4B层析柱（Pharmacia公司）。用结合缓冲液1稀释样品后通过层析柱。待流出液体的OD值为0.01时，用0.1 mol/L柠檬酸钠（pH2.6）洗脱层析柱，收集洗脱液。用5 mol/L Tris（pH8.8）调节pH至7.0，PBS透析。纯化的抗体进行SDS-PAGE电泳，如图3所示，单克隆抗体的分子量约147 kD，在还原剂的作用下，抗体分解为两个片段，其中重链50 kD，轻链25 kD。

图3 纯化单抗的SDS-PAGE电泳图

2.4 MAb 腹水效价测定及亚类鉴定结果

将分离纯化的PAT蛋白用包被缓冲液进行稀释，加入酶标板中（100 μL/孔），PAT蛋白的包被浓度为10 μg/mL；37℃孵育2 h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。将1 g非转基因大豆叶片总蛋白加入10 mL包被缓冲液中，在研钵中研磨，得到阴性对照液，将阴性对照加入酶标板中（100 μL/孔），即为阴性对照孔；37℃孵育2 h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。每孔加入100 μL含5%脱脂奶粉的磷酸缓冲液，37℃孵育30 min，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。

每孔加入100 μL上述纯化得到的单克隆抗体或其稀释液（用酶标抗体稀释缓冲液进行稀释），37℃孵育2 h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。每孔加入100 μL酶标二抗工作液，37℃孵育2 h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。每孔加入100 μL底物溶液，室温避光孵育60 min后，用酶标仪测定450 nm波长下的吸收值。

用将吸收值为阴性对照孔两倍以上的孔判断为阳性孔。杂交瘤细胞培养上清、小鼠腹水及纯化后抗体的结果，见表1。

表1 单克隆抗体4C2的效价

ISO-1 Capture ELASA试剂盒购自Sigma公司。取待测杂交瘤细胞上清液15 mL，加等量饱和硫酸胺，混匀后4℃过夜。次日10 000 r/min离心10 min，沉淀溶于500 mL去离子水。羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM 按1∶1 000稀释后包被96孔板，3℃作用1 h。PBS清洗，每孔加待测上清50 μL，室温作用1 h。加HRP-羊抗鼠二抗，室温作用30 min。OPD显色。No 6341细胞株分泌的单克隆抗体为IgG1亚类，结果如表2所示。

表2 单克隆抗体的亚类鉴定

2.5 双抗夹心ELISA 检测方法的建立

用包被液将兔抗Bar基因 IgG 作1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 稀释，100 μL/孔，每个稀释度一行，4℃过夜包被抗体；用100 μL 3% BSA作封闭剂，37℃封闭3 h；加入样品、PBS 空白对照，37℃ 40 min；加McAb 用稀释液将McAb 作1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600 稀释，加入酶标板中，每个稀释度作两列，37℃作用40 min，；加酶标二抗加入1∶5 000 稀释的HRP-羊抗鼠IgG，37℃温浴40 min，（以上步骤每次操作前均洗涤3次，并拍干液体）；加入新配制的TMB 底物显色液避光显色10-15 min，加入终止液，50 μL/孔，在酶标仪上读取OD450nm。以阳性孔OD 值接近1，P/N 值最大时，兔抗PPV IgG 和McAb 的最大稀释度为其最佳工作浓度。确定的兔抗PPV IgG包被浓度为1∶3 200；单抗稀释倍数为1∶800。

2.6 特异性和灵敏度试验

成分含量为1%、10%和100%的转基因玉米材料，所含转基因成分分别为Bt176（含bar基因）、T25（含bar基因）、MON810（不含bar基因）、GA21（不含bar基因）各1 g加入10 mL样品抽提缓冲液中，并研磨。提取的蛋白作为待测样本液，利用本研究建立的双抗夹心ELISA法检测，含有bar基因成分的样本，1%和10%含量均检测bar基因表达阳性，而含有其他转基因成分的样本，为检测阴性。该结果表明，制备的单克隆抗体与非转bar基因植物不发生交叉反应，而与Bt蛋白、EPSPS蛋白无特异性反应，依据此单抗建立的ELISA检测方法具有检测bar基因表达蛋白的良好特异性。从检测灵敏度来讲，此方法能够检出含bar基因转基因成分含量为1%的产品。对加工品的检测和与其他转基因植物內源蛋白的检测特异性，有待于进一步研究证明。

3 讨论

随着国内外对转基因产品检测研究的深入以及各国对转基因产品检测要求的提高，迫切地需要更准确、快速、安全、高效且成本低廉的检测技术的问世。酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）用于间接检测转基因表达的目的蛋白质，由于其快速、灵敏、可定量操作、简便、无需贵重仪器设备、且对样品纯度要求不高，特别适用于大批量样品的检测，在转基因成分快速检测领域有着极高的应用价值，其已被广泛用于转基因作物中外源基因表达的靶蛋白质水平的分析测定［10］。美国FDA 已研究出用双夹心ELISA 法检测食品中是否含有转基因玉米成分。EnviroLogix ELISA试剂盒可用于测定玉米中的Cry9C 蛋白，在同一实验室和实验室间共测定了9 种含玉米的食品，测定结果的重现性很好。Lipp等［11］使用ELISA 法，通

过抗体特异性地与CP4-EPSPS（5- 烯醇丙酮酰莽草酸-3- 磷酸合酶，来源于农杆菌CP4）蛋白结合，检测 抗草甘膦大豆（Rundup ready soybean，RRS）。对于bar基因表达的PAT蛋白的检测方法研究，国外已有相关试剂盒产品，但价格昂贵，不适用大批量筛选应用，而国内的检测方法研究普遍使用多克隆抗体，应用也仅限于实验室内部的初筛，因此开发稳定的，具有自主知识产权的PAT蛋白检测方法和产品，是本研究的任务之一。

图4 转基因玉米进行的ELISA方法特异性检测

本研究制备了表达PAT蛋白的单克隆抗体，并利用该抗体建立的ELISA 检测方法，通过转基因样品的验证，证实其与其他蛋白无交叉反应，效价高，达到107以上，并具有较高的检测灵敏度。检测指标满足国内检测标准的要求，有较强的实用性，此方法的进一步完善，有望为我国转基因成分监督和监测提供快速、安全、低成本的方法，为转基因作物安全监管提供了有力保障，具有良好应用价值。

4 结论

利用原核表达的PAT蛋白免疫小鼠，获得纯化抗PAT蛋白，并通过杂交瘤筛选技术获得了分泌一株抗PAT蛋白细胞株。利用该单克隆抗体本研究初步建立了检测bar基因表达蛋白ELISA检测方法。

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（责任编辑 狄艳红）

Development of A Monoclonal Antibody Sand wich ELISA for Detection of bar Gene Transgenic Plant and Element

Long Likun Li Congcong Zhang Ming Li Feiwu
（Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033）

This study induced prokaryotic express Bar protein, by protein Immunity of BALB/c mice, cell fusion and screening clones, we obtained a hybridoma cell line. In this study, using rabbit polyclonal IgG and hybridoma cells secreting monoclonal antibodies we established sandwich ELISA method for detection of bar gene intransgenic plant which showed good specificity and sensitivity . This study provides rapid and accurate.technical tool for a secure monitoring of GMO.

bar gene Hybridoma Monoclonal antibody GMO detection

2014-03-13

吉林省人力资源与社保厅项目博士后启动项目

龙丽坤，女，博士，副研究员，研究方向：转基因植物环境安全检测；E-mail：longlikun@126.com.

李飞武，男，硕士，副研究员，研究方向：转基因检测技术；E-mail：lifeiwu3394@sina.com