DAMPs和肾脏疾病

何　静　综述　施少林　审校

机体在长期生物进化过程中，发展了一套完备而复杂的系统去侦测细胞损伤，进而通过相应的受体和信号通路而做出应答，以期清除损伤，修复组织。外源病原体入侵是最常见的损伤信号，机体通过固有免疫系统模式受体(PRR)识别病原体所特有的模式分子，即PAMPs(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs)启动免疫应答。但在创伤、烧伤、缺氧、缺血-再灌注等病理状态下，即使无病原体入侵，机体仍可启动相似的炎症反应。1994年，Matzinger[1]的 “危险模式”理论就此问题给出回答，明确提出机体自身细胞损伤释放的内源性分子可以与PAMPs相类似的方式启动免疫应答。这些内源性分子和PAMPs合称DAMPs(damage associated molecular pattern,DAMPs)。后续研究则将细胞损伤释放的内源性分子单独称为DAMPs或者警觉素(Alarmins)，本文所指DAMPs即是此类。生理情况下，多数DAMPs分子参与维持细胞或组织自身稳态；在机体受到损伤时，DAMPs由于细胞或组织定位的异常或数量异常增多，而为机体识别为损伤信号而启动免疫应答。Bianchi[2]概括DAMPs的特点：(1)由受损或坏死细胞而非凋亡细胞快速释放；(2)由某些激活的免疫细胞(尤其是专职APC)借助分泌系统(非经典途径)或内质网-高尔基分泌途径而释放；(3)招募表达模式受体(PRR)的固有免疫细胞，直接或间接激活适应性免疫；(4)可以促进损伤组织的重构。

常见的DAMPs

高迁移率族蛋白1(HMGB-1)HMGB-1是目前最广为人知的DAMP。该分子高度保守，组成性表达于各种组织的细胞核中，其功能主要是使双螺旋极度扭曲以利于各种转录因子和染色质相互作用。HMGB1可由PAMPs刺激固有免疫细胞主动分泌和细胞损伤被动释放。HMGB1在无菌性炎症中是一早期炎症介质，而在感染中却是一晚期炎症介质[3]。HMGB1主要通过与Toll样受体4(TLR4)结合发挥作用，其他可能的受体包括糖基化终产物受体(RAGE)、TLR2、TLR9等。

S100蛋白家族S100蛋白家族为一组钙结合蛋白，有20个成员，广泛参与调节细胞增生、分化、迁移、凋亡、钙稳态，肿瘤的发生、发展、转移，炎症等生理病理过程[4]。主动分泌或被动释放的S100主要通过与RAGE、TLR4受体结合，调节炎症反应，在不同疾病状态下发挥促炎或抗炎的特性，并参与组织修复[5,6]。

热休克蛋白家族(HSPs)HSPs作为分子伴侣参与新合成多肽链的正确折叠，多种应激状态下，表达上调，作出对机体保护性反应。组织坏死时，大量释放到细胞外，通过与TLR受体结合，刺激抗原提呈细胞(APC)成熟、分泌多种促炎因子，并参与到对抗原肽的提呈过程。Osterloh等[7]认为HSPs是连接损伤信号和模式识别的重要媒介。

循环核酸分子病原微生物DNA或RNA均可作为PAMPs，通过TLR等模式受体结合，激发免疫应答。这提示哺乳动物细胞受损释放到循环的核酸分子，可能作为DAMPs，介导机体固有免疫反应。此外，Zhang等[8]证实创伤病人循环中mtDNA水平升高，并用体内体外实验验证mtDNA可能通路TLR9/p38MAPK通路介导炎症损伤。

尿酸盐痛风是由尿酸盐结晶在病变组织的沉积而造成的无菌性炎症。同时，受损细胞释放的可溶性尿酸钠尚可作为危险信号，与炎症小体(Inflammasome)结合，介导炎症反应[9]。

细胞外基质(ECM)DAMPsECM具有支持、连接细胞，影响细胞生长、分化、迁移等重要作用。在组织损伤时，坏死细胞释放的蛋白酶不仅可以通过降解ECM而产生游离的二聚糖蛋白、透明质酸、多功能蛋白聚糖等分子，而且可刺激巨噬细胞或固有细胞分泌这些分子，作为DAMPs与TLR受体或NLRP3受体结合，介导炎症反应[10]。

其他DAMPs其他候选的DAMPs包括终末糖基化产物(AGEs)、半乳凝素、硫氧还原蛋白、ATP、腺嘌呤、T-H糖蛋白(THP)、白细胞介素33(IL-33)等。THP蛋白也称尿调节素，由髓袢升支粗段分泌，是尿中含量最丰富的蛋白质。研究证实THP蛋白可作为肾脏疾病和异体排斥反应良好的生物标志物[11]。THP蛋白一方面可通过与TLR4结合，刺激树突状细胞成熟、分泌多种细胞因子[12]，另一方面可减弱炎症反应[13]。所以，THP可能作为肾小管损伤的DAMPs，参与肾小管损伤预警、修复。

DAMPs受体

从提出DAMPs的概念以来，随着研究的深入，发现介导PAMPs的PRR同样可介导DAMPs的信号转导，如TLRs、NLRs、RLRs，它们共享着同样的信号转导途径(表1)。RAGE作为多功能受体，除与经典的AGEs结合，此外尚能结合S100蛋白家族、淀粉样蛋白、HMGB1蛋白等DAMPs结合，放大炎症反应，参与包括糖尿病、阿尔茨海默病、肿瘤、各种炎症状态等疾病[3]。Inflammasome是胞质中巨大的复合体，包括NLR受体(如NLRP3)、接头蛋白ASC、效应蛋白(如Caspase-1)，主要通过激活Caspase-1，释放IL-1β和IL-18等细胞因子，参与DAMPs导致病理损伤的过程[14]。

表1　常见的DAMPs及其受体

DAMPs和肾脏疾病

无菌性炎症广泛参与肾脏疾病的发生发展，但目前仍缺乏针对肾脏炎症和免疫机制的特异性、有效的治疗。阐明来源于肾脏固有细胞和免疫细胞DAMPs及其肾脏疾病发生发展中的机制和作用，对寻求新的治疗靶点具有重要意义[15]。研究证实，DAMPs 参与多种肾脏疾病。如DAMPs-TLRs通路在肾脏缺血-再灌注损伤(IRI)及多种肾小球肾炎中均发挥重要作用(图1)。

图1　PAMPs、DAMPs在肾脏疾病发病机制的作用[16]

急性肾损伤(AKI)

IRI是AKI发生的重要的病理生理机制，其中肾小管损伤作为中心事件激活固有或适应性免疫系统，产生炎症反应。肾小管在急性肾损伤发生中并不是旁观者，而是积极参与者，本身可表达PRR如TLR2、TLR4、RAGE，与组织损伤释放的DAMPs结合介导炎症损伤[17]。尽管目前已有文献证实，HSPs可由细胞坏死释放或细胞主动分泌到细胞外，作为DAMPs介导炎症反应[18]，但在AKI的研究中，关注点仍然在细胞内的HSPs调节应激反应上，如在IRI动物模型中，全身性表达或选择性表达HSP27可以保护肾脏，减轻损伤[19，20]。以上线索提示HSPs极有可能作为DAMP参与AKI。Rabadi等[21]证实，在IRI动物模型中，肾脏缺血25 min，HMGB1即可释放到肾脏静脉中；给予HMGB1释放抑制剂丙酮酸乙酯可以保护肾脏缺血再灌注损伤，减少TNFα和IL-8释放。TLR2、TLR4敲除动物经缺血再灌注，均可呈现较轻肾脏炎症和损伤[22，23]，提示DAMPs可能通过TLR2/TLR4促进炎症和损伤。

糖尿病肾病、原发性肾小球肾炎

已有大量文献证实AGEs和RAGE在糖尿病肾脏发病中的作用。db/db、链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠模型中，足细胞RAGE表达上调，刺激下游血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达上调，同时招募炎细胞，参与系膜增生、肾小球硬化病理过程；RAGE基因敲除，或者给予可溶性RAGE(sRAGE)处理，可使糖尿病小鼠肾脏损伤减轻[24]。AGEs、RAGE和其他的DAMPs同时参与非糖尿病型肾小球疾病。阿霉素小鼠是经典的足细胞损伤动物模型，Guo等[25]证实，该模型中肾组织中有大量的RAGE配体的释放，如AGEs和S100B，足细胞RAGE表达上调，RAGE敲除和sRAGE处理的小鼠可以减轻蛋白尿，减少足突融合，保护肾脏。冷球蛋白肾炎模型中，TLR4在足细胞特异性表达上调，同时纤维蛋白原在肾组织沉积增加，体外同时给予TLR4的配体Lipid A和纤维蛋白原刺激足细胞可诱导出相似的炎症反应，提示纤维蛋白原在此模型中可能作为DAMP通过与TLR4结合发挥促炎作用[26]。肾毒性肾炎模型中，小鼠肾脏分泌HSP60增加，将无内毒素HSP60注射到模型小鼠加重病情，提示HSP60作为DAMP可能通过激活T细胞依赖的细胞毒作用发挥效应[27]。Sadlier等[28]利用基因芯片技术，分析抗Thy-1抗体诱导的肾炎动物模型肾组织转录组学，发现S100蛋白家族多名成员表达上调。一项关于抗中性粒细胞胞质抗体相关血管炎(AAV)临床研究发现，AAV肾损害的患者血清中HMGB1显著升高，疾病部分缓解，HMGB1水平可下降，肾组织免疫荧光染色发现HMGB1在活动组较不活动组表达明显增多，提示HMGB1与肾脏炎症水平有关[29]。

肾脏纤维化

肾脏纤维化是慢性肾脏疾病最终导致终末肾功能衰竭的共同通路。Sörensen等[30]在 UUO小鼠动物模型观察到来源于血循环中漏出的纤维蛋白原作为DAMP，通过TLR2/TLR4/Myd88依赖的方式促进肾脏成纤维细胞增生，分泌细胞外基质，加速肾纤维化形成。二聚糖蛋白可能也是一种促纤维化的DAMP，Babelova 等[31]在UUO小鼠动物模型中观察到肾组织二聚糖蛋白表达上调，并通过与TLR2、TLR4、P2X受体作用，共同激活NLRP3-Inflammasome，促进IL-1β的释放；二聚糖蛋白基因敲除小鼠，IL-1β释放减少。

狼疮性肾炎

系统性红斑狼疮(SLE)患者体内存在凋亡细胞清除障碍，因而可向循环中释放大量的DAMPs[32]。循环DNA作为自身抗原参与SLE的发生很早即为人们所认识，但其机制的阐述进展缓慢。DNaseI基因敲除小鼠由于不能降解游离DNA，而导致SLE的表以及合并狼疮性肾炎，为循环DNA作为DAMPs参与炎症损伤提供了直接的佐证[33]。HMGB1与多种自身免疫性疾病有关。SLE患者循环中的HMGB1升高，提示HMGB1可能参与自身免疫诱导的肾脏损伤[34]。Tian等[35]研究发现HMGB1参与DNA自身免疫复合物的形成，该复合物中HMGB1与RAGE受体结合，低甲基化的DNA与TLR9结合，两者协同信号传导，激活免疫细胞，产生损伤。

肾移植

肾移植不可避免地存在IRI。移植肾来源的DAMPs，如HMGB1、ATP、尿酸、IL-1α等都可能影响移植肾功能的恢复。Krüger等[36]研究发现人类的肾移植中，尸体供肾较活体供肾组织中TLR4和HMGB1明显上调；如果尸体供肾存在TLR4的基因点突变，肾组织的炎症因子水平下降。Bergler等[37]在动物模型中发现同种异基因移植较同种同基因移植，肾组织中TLR4和纤维蛋白原表达上调，提出纤维蛋白原/TLR4通路参与肾移植排斥损伤的形成。S100A8、S100A9在移植肾的肾穿刺标本的高水平表达是移植肾肾功能的重要预测因素[38]。

小结：肾脏损伤是一个复杂的病理生理过程，涉及固有免疫和适应性免疫。坏死细胞释放的DAMPs可以激活固有免疫细胞，引起下游的炎症反应，联系适应性免疫，参与肾脏损伤的发生发展和给予机体损伤的预警。关注DAMPs在肾脏损伤中的作用，为我们理解肾脏损伤发生的提供了新视角和寻求新的治疗靶点提供切入点。

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