抑瘤素及其受体在高脂饮食大鼠肾组织中的表达和意义

郝亚宁　李莎莎　隋燕霞　赵　菲

脂质代谢紊乱常是慢性肾脏病进展的独立危险因素。研究表明脂质异常可使肾组织内某些生物代谢紊乱、血流动力学及流变学改变，导致并加重蛋白尿和肾脏病理变化[1]，炎细胞浸润和多种细胞因子的表达失调在脂质肾损伤的发生发展中尤为重要[2]。抑瘤素M(OSM)属新近发现的白细胞介素6(IL-6)家族成员，为一种多功能的细胞因子[3]。OSM有Ⅰ型和Ⅱ型两种受体，其中Ⅱ型受体为OSM特异性受体，由一个gp130分子和一个OSM特异性受体β亚单位(OSMRβ)构成，OSM可通过与Ⅱ型受体特异性结合介导其独特的生物学活性，包括参与炎症反应、调节胆固醇代谢、刺激造血及促进组织修复再生等作用[4]。新近研究显示OSM可调节人近曲肾小管上皮细胞的分化和转分化[5]，OSM/OSMR可参与肾脏急性损伤的发生与发展[6]，但OSM/OSMR是否参与脂质肾损害病理过程，目前国内外研究较少，本实验拟通过建立高脂动物模型，观察在高脂环境下，肾脏的病理改变和在此过程中OSM及OSMR的变化，为脂质肾损害发病机制提供新的理论依据。

材料与方法

动物分组30只SD大鼠体重在120～140g(西安交通大学医学院动物中心提供)，适应性喂养1周后，随机分为对照组和高脂组各15只。对照组以普通饲料喂养，按参考文献[7]给高脂组大鼠以高脂饲料，配方为82.3%基础饲料加2%胆固醇、0.5%胆酸钠、10%猪油、5%蛋黄粉和0.2%丙硫氧嘧啶，二组均自由饮水。

观察指标及检测方法

生化检测12周时将大鼠置于代谢笼中，收集24h尿液，自动生化分析仪检测尿肌酐、考马斯亮蓝法测24h尿蛋白定量。处死大鼠后腹主动脉取血5～6 ml，分离血清，自动生化分析仪检测血清总胆固醇(CH)、三酰甘油(TG)、空腹血糖(FPG)、肌酐(SCr)及尿素氮(BUN)，计算内生肌酐清除率(Ccr)：Ccr(ml/min)=[尿肌酐(mmol/L)×尿量(ml)]/[SCr(mmol/L)×1 440 min][8]；放射免疫法检测大鼠空腹胰岛素水平(FINS)，胰岛素抵抗指数稳态模型评估法(HOMA-IR)计算胰岛素抵抗指数(IRI)，IRI=(FPG×FINS)/22.5。

大鼠血清OSM浓度检测ELISA试剂盒(96T)购自美国RDBiosciences公司。按照该试剂盒使用说明书对原倍标准品进行倍比稀释，取相应大鼠血清标本40 μl，加抗OSM抗体10 μl、链霉亲和素-HRP 50 μl，并设复孔。室温孵育30 min，洗涤液洗涤30s×5次，每个孔依次加显色液A50 μl和显色液B50 μl，震荡混匀10s，37℃暗处反应10 min。最后每孔加入终止液50 μl，终止反应。于450 nm波长依序测定各孔的吸光度即OD值。用CurveExpert 1.3软件绘制出标准曲线，根据待测样品的OD值可在标准曲线上计算出相应的OSM的含量。

肾脏病理12周末处死大鼠后，取肾脏称重，一侧肾脏由于石蜡切片，行HE、PAS染色，光镜下观察肾组织病理学改变情况。另一侧肾脏置-80℃冰箱保存备用。

免疫组化SP法兔抗大鼠OSM多克隆抗体、兔抗大鼠OSMR多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，均采用SP法，石蜡切片60℃烤箱2h以上，常规脱蜡至水化，3%H2O2甲醇溶液消除内源性过氧化物酶，石蜡切片置pH 6.6的柠檬酸缓冲液中，放于抗原修复仪5 min后自然冷却。蒸馏水洗3次，正常山羊血清室温封闭30 min后倾去勿洗，分别滴加1∶100的兔抗大鼠多克隆抗体OSM、OSMR于4℃过夜，二抗羊抗兔IgG室温30 min，PBS漂洗3次后分别滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温孵育30 min，PBS漂洗3次；然后加入DAB室温显色1～2 min，光镜下观察着色情况，蒸馏水漂洗；再分别加入苏木精染料2 min，1%氨水返蓝，常规脱水、透明、封片并用显微镜成像系统采集图片，OSM、OSMR免疫组化染色切片在光镜下放大400倍，每张切片随机选取5个视野，采用评分法，按染色程度、阳性范围进行评分，最终分数相加，再进行比较。

Western Blot法检测OSM及OSMR蛋白的表达取新鲜冻存肾脏组织0.05g加入蛋白裂解液0.5 ml，用匀浆器在冰上将肾脏组织匀浆并在冰上裂解20 min后于4℃ 15 000 r/min离心15 min收集上清液，考马斯蓝法测蛋白定量。取50 μg上清液蛋白上样，10%SDS-聚丙烯胺凝胶电泳分离，将凝胶内蛋白质转移到硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉室温摇床上封闭1h，根据OSM及OSMR蛋白分子量大小裁膜，并分别加入兔抗大鼠OSM及OSMR一抗(1∶250)，4℃孵育过夜，TBST洗膜液洗涤5 min×6次，再分别加入羊抗兔IgG二抗，室温孵育1h，TBST洗膜液洗涤5 min×6次，免疫荧光分析仪检测蛋白表达，以Odyssey图像处理系统分析蛋白表达灰度值，实验结果用目的条带灰度值与内参GAPDH蛋白条带灰度值的比值来表示。

统计学处理采用SPSS 18.0统计软件，计量资料结果采用均数±标准差表示，两组资料比较采用t检验，相关性分析满足正太分布的数据采用pearson相关性分析，非正态分布的数据采用spearman相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为统计学差异显著。

结　　果

观察指标的变化高胆固醇饮食造模12周时，高脂组大鼠血清CH、24h尿蛋白定量较对照组明显升高(P<0.05)，而两组TG、Ccr无明显差异(P>0.05)。高脂组OSM、FINS、FPG及IRI均较对照组明显升高(P<0.05)(表1)。

表1　两组大鼠观察指标的变化

图3　肾脏组织中OSM及OSMR蛋白的表达

肾脏病理光镜下高脂组肾小球系膜细胞及基质稍增多，肾小管上皮细胞淡染、体积增大、胞质增多，未见明显的空泡形成。

免疫组化(1)高脂组OSM主要表达于皮质肾小管上皮细胞胞膜和胞质、部分间质炎性细胞胞质及胞膜，肾小球内几乎无表达(图1)；(2)与对照组比较高脂组OSMR表达明显增加，主要位于皮质肾小管上皮细胞胞质及胞膜、肾间质，肾小球内皮细胞胞质少量表达，其余肾脏固有细胞几乎无表达(图2)。

图1　抑瘤素M在高脂组(B)皮质肾小管上皮细胞胞质及胞膜可见阳性表达，肾小球内几乎无表达(↑)(SP，×400；A：对照组)

图2　抑瘤素M受体在高脂组(B)主要表达于皮质肾小管上皮细胞胞质及胞膜(↑)(SP，×400；A：对照组)

肾组织Western Blot检测OSM及OSMR蛋白表达情况高胆固醇饮食造模12周时，高脂组肾组织Western Blot检测可见111 kD及28 kD处有一深色条带分别对应OSMR及OSM。根据灰度分析提示OSM及OSMR表达明显上调(图3A)，与对照组比较具有显著性差异(P<0.05)(图3B、C)。

高脂组血清OSM与24h尿蛋白定量、FPG和IRI相关性分析将高脂组大鼠血清OSM浓度与24h尿蛋白定量、FPG、IRI、CH和TG进行相关性分析。结果显示高脂组大鼠血清OSM浓度与24h尿蛋白定量(r=0.979)、CH(r=0.969)及TG(r=0.963)呈高度正相关(P<0.01)与FPG(r=0.63)、IRI(r=0.82)也呈正相关(P<0.05)。

讨　　论

1982年，Moorhead等[9]首次提出“脂质肾毒性”学说，认为脂质代谢紊乱和肾脏损害之间存在恶性循环，即肾脏损害导致脂质代谢紊乱，而脂质代谢紊乱进一步加重肾脏损害。流行病研究亦提示肥胖及由此而引起的代谢综合征是预测慢性肾脏病的独立危险因素[10]，其涉及的机制包括炎症反应、脂质毒性和血流动力学变化等。本实验参考文献采用高脂饲料喂养SD大鼠12周，光镜下肾小球系膜细胞及基质略增多，肾小管上皮细胞体积增大，胞质增多，但未见既往文献报道的肾小球局灶硬化及明显肾小管间质损伤[11]，可能与造模时间较文献报道的15周短有关。

高脂饮食产生的胰岛素抵抗常伴高胰岛素血症，这是胰岛β细胞分泌亢进和胰岛素清除障碍的结果[12]。胰岛素水平增高对脂肪细胞具有促进脂肪分解，形成大量的游离脂肪酸(FFA)[13]。FFA升高是胰岛素抵抗形成的重要病理因素，即所谓的脂毒性[14]。有研究报道，非糖尿病患者胰岛素抵抗与慢性肾脏病的风险增加有关[15]。胰岛素抵抗可通过两个途径导致肾脏损伤，一是高胰岛素血症可直接作用肾脏血管，引起肾小球肥大和硬化的发生。此外可通过高脂血症、高血压等，促进炎性细胞因子如 IL-6、C反应蛋白及肿瘤坏死因子α明的表达，引发炎症反应等导致肾脏损伤[16]。实验大鼠血清CH、TG、FPG、FINS、IRI及24h尿蛋白定量较对照组明显升高，表明高脂组大鼠胰岛素敏感性下降，存在胰岛素抵抗、高胰岛素血症和高血糖状态。

OSM作为IL-6细胞因子家族成员，主要由活化的T淋巴细胞、单核巨噬细胞分泌，可广泛作用于体内外多种细胞。有研究发现在肾脏发生一定损伤的情况下，OSM/OSMR能通过激活Jak/Stat及ERK1/2信号通路诱导人肾小管上皮细胞间充质转分化参与肾间质纤维化[17,18]。本实验高脂组大鼠血清中OSM水平明显升高，免疫组化及Western Blot检测均显示OSM/OSMR在肾脏组织表达较对照组明显增加，此外，通过相关性分析还发现，血清OSM浓度与24h尿蛋白量、血脂、及IRI均高度正相关，提示脂质肾损害可能是通过高脂、胰岛素抵抗、高脂饮食时肾组织中炎症因子OSM/OSMR表达增多，引起肾脏损害的具体分子机制尚需进一步研究证实。

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