血栓性微血管病血清标志物诊断方法的建立与评估

张　涛　梁少姗　谌达程　郑春霞　曾彩虹　章海涛　陈慧梅　刘志红

血栓性微血管病(TMA)是一类病理损伤，临床上特征性表现为多器官微血管血栓形成，并引起血小板减少、微血管病性溶血和脏器功能障碍；其主要发病机制是血管内皮细胞的损伤[1]。TMA通常表现为溶血性尿毒综合征(HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)[2]，导致TMA的疾病包括系统性红斑狼疮、抗磷脂抗体综合征、恶性高血压、先兆子痫、感染、药物相关内皮损伤及器官移植术后血管性排斥等[3-5]。

TMA以溶血性贫血、血小板减少和脏器缺血性失功为临床表现，肾脏是主要的受累器官之一[6,7]。越来越多的证据表明，肾脏存在TMA预示着肾脏的存活率和预后较差，及时的诊断和治疗尤其关键[7，8]。目前，肾活检是TMA病理诊断的金标准，但临床上，TMA患者经常存在凝血功能异常、血红蛋白(Hb)下降、血小板低下和病情危重等禁忌证，难以及时行肾活检并指导治疗[9,10]。一些临床表现和特异的实验室指标提示TMA病变，包括Hb、血小板的下降，内皮功能的异常，以及乳酸脱氢酶(LDH)的明显上升等，但目前尚无统一的标准[11,12]。因此，本研究比较分析了TMA患者的实验室指标，以期提供TMA早期诊治和预测预后的非创伤性方法。

对象和方法

研究对象选取2011年7月至2012年7月于南京军区南京总医院肾脏科疑诊的TMA患者。入选标准：(1)肾功能损害(蛋白尿、血尿或肾功能不全，血清肌酐(SCr)>109.6 μmol/L);(2)微血管病性溶血性贫血(Hb<12 g/dl[11 g/dl,女])，外周血红细胞碎片阳性(>5个)，LDH升高(LDH>240 U/L)；(3)病程中有血小板下降(最低值<100×109/L)；(4)临床及肾脏病理资料完整，初次资料在免疫抑制治疗或血浆置换前获得。均随访至2013年10月，临床资料不完整或随访少于12月患者予排除[13,14]。

入选建模组的疑诊TMA患者共220例，其中肾活检明确诊断TMA 51例。验证组包括46例另外疑诊TMA患者和157例疑诊TMA的系统性红斑狼疮(SLE)患者，两组分别确诊TMA病变20例和27例，研究的设计流程见图1。

图1　研究流程图

临床资料和实验室结果收集患者年龄、性别、起病至确诊时病程，并发症及实验室检查：活检时24h尿蛋白定量、镜下血尿、Hb、血小板、SCr、血清球蛋白、补体C3/C4、LDH、血管性血友病因子裂解蛋白酶13(ADAMTS13)酶活性及抗体。内皮指标包括血栓调节蛋白(THBD)、E选择素、可溶性血管细胞黏附分子1 (sVCAM-1)和正常内皮细胞(NEC)。

血清ADAMTS13活性是由荧光共振能量转移法(Fluorescence Resonance Energy TrANSFER,FRET)测定，此方法通过ADAMTS13蛋白酶水解重组的血管性血友病因子86(vWF86)-ALEXA FRET底物，从而解离ALEXA荧光物质，使可检测到的荧光增加，以此量化ADAMTS13的活性[15]。血清抗ADAMTS13 IgG抗体(SekisuiDiagnostics，美国)、vWF的(Sunbiote，中国)、THBD(Diaclone，法国)、E选择素(R&D，美国)和sVCAM-1( R&D，美国)都采用酶联免疫吸附法测定。NEC在循环中的浓度，使用磁珠分选法(MACS，德国)测定[16]。

病理资料与相关定义所有病例均在B 超引导下行肾活检术。肾穿刺活检组织经甲醛固定,石蜡包埋,切片厚度为2 μm,肾组织进行光镜、电镜及免疫荧光检查。光镜染色包括HE,PAS,PASM-Masson及Masson三色染色。肾活检标本要求肾小球数≥10个，间质小血管和入球动脉> 10个。TMA定义为至少一个肾小球或者小动脉可见闭塞性纤维蛋白-血小板血栓，同时具有以下病变之一：(1)光镜肾小球“双轨样”改变,电镜肾小球内皮下间隙疏松、增宽；(2)肾小球袢腔内纤维素样血栓和(或)变形的红细胞；(3)动脉管腔内纤维素样血栓和(或)变形的红细胞；(4)动脉黏液样变性、动脉葱皮样改变或动脉内膜纤维性增生；(5)肾皮质坏死[7,17]。

SLE诊断标准为1997年美国风湿病学会修订版SLE诊断标准[18]。随访肾脏终点事件包括SCr倍增、死亡或进入终末期肾病(ESRD)，ESRD定义为估算的肾小球滤过率(eGFR)<15 ml/(min·1.73m2)或进入维持性肾脏替代治疗。肾功能稳定定义为SCr维持正常范围或上升少于初发的50%。肾存活率定义为随访中未进入ESRD或未达死亡患者的比例，人生存率定义为随访存活患者所占比例。

统计方法采用SPSS 19.0软件录入和整理资料并进行统计学分析。两组间资料比较采用Mann-Whitney检验或卡方检验。Logistic回归用于与TMA相关实验室指标的综合分析，并采用受试者工作特征(ROC)曲线获取分界值，以最佳拟合模型的曲线下面积(AUC)计算，进行灵敏度和特异的评价。并运用Bootstrap方法和Hosmer-Lemeshow检验交叉验证所建模型的拟合度。累计肾脏生存率采用Kaplan-Meier生存概率计算。所有统计学检验均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为统计学差异显著。

结　　果

一般情况据肾活检病理结果，入建模组的220例疑诊患者中，分为TMA组(n=51)和非TMA组(n=169)，两组患者年龄、性别无明显差异。TMA组中特发的HUS/TTP患者15例(29.4%)，继发的 TMA患者36例(70.6%)，继发疾病主要为自身免疫性疾病29例(56.9%)，余为妊娠5例(9.8%)，恶性高血压1例(1.96%)，器官移植1例(1.96%)(表1)。

表1　TMA患者和非TMA患者肾活检时的临床资料及实验室指标

续表1

实验室指标中两组间在血小板、Hb、LDH、SCr、ADAMTS13活性和THBD 有明显差异(均P≤0.001)，TMA组患者较非TMA组发病时SCr、LDH和THBD水平明显增高，而Hb、血小板、ADAMTS13活性水平都明显减低，而24h尿蛋白、尿沉渣、补体、球蛋白、NEC、E选择素、VCAM及ADAMTS13抗体、vWF水平无显著差异。两组随访12月TMA组患者预后更差，肾存活率仅为54.9 %，非TMA组肾存活率为74.6%,两组间有差异(P=0.015)，1年累计肾脏Kaplan-Meier生存率两组间差异显著(P=0.002,图2)。随访观察两组间人存活率无明显差异(P=0.115)(表1)。

图2　TMA组患者和非TMA组肾生存率的比较

Logistic回归模型的建立基于建模组患者的实验室资料， 6个实验室指标(血小板、Hb、LDH、SCr、ADAMTS13活性和THBD)在TMA组和非TMA组间有显著差异(均P<0.05)，以P值0.05作为纳入界值，这6个指标被进一步纳入多因素Logistic回归分析，用逐步法建立模型，综合分析结果表明SCr，血小板，LDH和ADAMTS13活性为肾脏TMA病变的有效预测指标(均P<0.05，表2)，建立Logistic 回归方程：

Logit P=-0.371-0.002×ADAMTS13活性+0.140×SCr+0.004×LDH-0.010×PLT

以上方程诊断TMA病变的预测概率拟合ROC曲线，AUC为0.800(95%CI 0.723～0.877，P<0.001，图3)。当分界值取0.248时，大于界值即为TMA,这个诊断模型的敏感度为81.6%，特异度为66.9%。

图3　诊断模型预测220例建模组中TMA的ROC曲线

表2　TMA相关实验室指标的Logistic回归分析结果(n=220)

诊断模型的验证应用Bootstrap方法对诊断模型进行验证，这结合四个实验室指标诊断模型的交叉验证AUC为0.803，校准曲线的截距和斜率分别为0.07和0.64。运用Hosmer-Lemeshow检验诊断模型，其拟合度良好(P=0.489)，交叉验证两曲线间关联紧密。

在独立的46例疑诊患者中进行这一诊断模型的进一步验证。这46例患者的相关临床资料见表3，其中肾活检诊断为TMA的患者20例(43.5%)，非TMA患者26例(56.5%)。TMA诊断模型在46例患者中预测TMA病变的AUC为0.815 (95%CI 0.685～0.946，P<0.001，图4)。取分界值0.248，这组患者中诊断模型的敏感度为75%，特异度为84.6%。

表3　独立的验证组患者的实验室指标(n=46)

图4　诊断模型在独立的验证组中验证的ROC曲线

在157例疑诊有TMA病变的SLE患者中再次进行了这一诊断模型的验证，这组患者中肾活检诊断为TMA的患者27例(17.2%)，非TMA患者130例(82.8)，两组患者间年龄、性别无差异，在这组患者中诊断模型预测TMA病变的AUC达0.852(P<0.001，图5)。取分界值为0.248时，这个诊断模型的敏感度为83.3%，特异度为73.0%。

图5　诊断模型在SLE患者组中验证的ROC曲线

表4　系统性红斑狼疮验证组患者的临床资料及实验室指标(n=157)

讨　　论

TMA这一病理损伤的发病机制目前仍未清楚，可能是多种机制联合作用，包括血管内皮细胞损伤、凝血纤溶障碍、自身免疫及遗传等。病因更是多种多样，如感染、药物、化学物质等，故TMA发病率低，但并不罕见，特别是继发性TMA，目前报道继发TMA又以SLE为首[3,7,19,20]。TMA临床表现复杂，症状缺乏规律性，目前诊断标准尚难以统一[21,22]，确诊需要肾活检证实存在微血管血栓，因此，无创的诊断方法有广阔的运用前景。本研究基于TMA相关的实验室指标变化，建立了新诊断模型，并进行了系统验证，这一诊断模型无创，可准确地预测组织学上的TMA病变。而据目前资料，这是首次提出预测TMA病变的无创诊断模型。

既往研究表明，TMA病理变化和患者肾脏预后显著相关，TMA患者其肾脏预后差[23,24]。本研究中肾活检确诊TMA的患者肾脏预后不良，肾脏终点事件发生率高于非TMA者，1年肾累计生存率明显低于非TMA患者，这也和相关报道[25]。根据肾活检病理是否为TMA分组，建立的Logistic回归模型中包含4个实验室指标(SCr，LDH，血小板和ADAMTS13活性)，这些实验室指标易于检测，便于动态观察。

这一诊断模型中4个实验室指标与临床症状和(或)TMA组织学病变明显相关。TMA病变的临床主要特征之一即为血栓形成，血小板减少，约90%的患者可出现血小板减少，严重者血小板下降明显，可达1万/ml以下，血小板减少程度和持续时间与肾功能衰竭可不一致[26]。相关报道显示TMA病变患者中肾脏受累达40%～80%，表现为尿检和肾功能异常[7]，本研究患者皆有肾脏受累，可能与患者皆为肾内科首次诊断有关。同时LDH的水平变化通常也反映组织缺血及溶血程度，是临床经常监测病情变化的指标之一，但LDH异常在其他脏器损伤中也常常观察到[27,28]。ADAMTS13在TMA研究进展中备受关注，近期研究表明ADAMTS13 的严重缺乏与遗传性TTP明确相关，ADAMTS13活性常低于正常人的5%，但ADAMTS13活性减低也报道见于妊娠、肝病、自身免疫性疾病及慢性炎症患者[29,30]。所以，这些实验室指标异常是常见和非特异性的，单个指标运用于TMA的诊断是很困难的，本研究采用Logistic回归综合分析相关实验室指标，由于Logistic回归中计算结果与自变量的分布类型无关，这使其分析较常规分析更稳健，可很好地处理协变量问题，并动态连续观察回归指标，从多变量中筛选出相关性好的诊断指标，构建可靠的回归方程，有助于临床诊断[31]。

本研究中构建的Logistic回归方程，AUC达0.800，预测概率取界值0.248，这一模型诊断TMA病变具有极好的灵敏度(81.6%)和良好的特异度(66.9%)，交叉检验也说明这一诊断模型拟合度良好。进一步在46例独立的疑诊TMA患者中的验证AUC为0.815，相同界值下敏感度为75%，特异度为84.6%。而在SLE患者中的验证有更大的AUC和更高的灵敏度和特异度，在SLE患者中有更高的检验效率和诊断准确性。这对SLE患者肾脏病理进行分类、预后判断和选择治疗都有益处，而且这还是非创伤性的诊断方法，在临床应用极具潜力。

总之，TMA患者肾脏预后不良，需要及时诊治，本研究提出了包含4个实验室指标的诊断模型，为临床提供了无创的TMA诊断方法，相关验证也说明了该模型具有较高的诊断价值。当然，本研究也有其局限性。首先，这是回顾性研究，需要前瞻性队列研究进行验证；其次，入组患者疾病谱较窄，继发因素以自身免疫疾病患者为主，其他病因例数较少；验证中也使用了非独立的数据，无法更深入地评估这一诊断模型的实用性。

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