线粒体DNA拷贝数检测方法的建立及在肾脏疾病诊断中的应用

何　静　夏　虹　张昌明　刘志红　施少林

线粒体是真核细胞内主管能量代谢的细胞器。不同类型细胞内线粒体的数量从几百个到几千个不等。线粒体DNA(mtDNA)是位于线粒体内裸露的双链环状DNA分子，通常每个线粒体含有2～10个拷贝[1]。人类mtDNA全长16.6 Kb，含37个基因，分别编码13个蛋白、22个线粒体tRNA和2个线粒体rRNA。线粒体功能的实现依赖于mtDNA基因复制、转录[2]，因而细胞内mtDNA数量变化必然引起线粒体功能的改变。线粒体是氧化磷酸化反应的中心，可产生大量自由基，对mtDNA造成损伤；加之mtDNA缺乏核DNA所具有的组蛋白保护及完备的DNA损伤修复机制，因而比基因组DNA更易受到损伤。损伤的mtDNA通过自噬途径降解，细胞内mtDNA总数量减少，从而影响线粒体功能[3-5]。

细胞内及循环mtDNA拷贝数的变化与人类多种疾病相关，包括糖尿病及其并发症[6]、肥胖[7]、肿瘤[8]、HIV感染[9,10]等。此外，mtDNA拷贝数变化也与生长发育[11]、生育[12]、老年化[13]、环境变化[14]和体育锻炼[15]相关。然而，mtDNA拷贝数变化能否反映肾脏细胞的损伤、成为肾脏疾病的生物标志分子，目前尚无此类研究。为解决这些问题，我们首先尝试建立一种精确、稳定和经济地测定mtDNA拷贝数的方法。

目前，文献中测定mtDNA拷贝数的方法主要是Taqman探针法实时(Real-time)PCR[16]。但是，Taqman探针价格昂贵，不适宜高通量检测。与Taqman探针相比，SYBR Green Ⅰ 染料法成本低廉，使用简便，适宜大批样本检测。为此，本研究旨在建立mtDNA拷贝数的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法，并探讨其在肾脏疾病诊断及足细胞损伤检测中的应用。

材料与方法

主要试剂和仪器DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)，Nco Ⅰ限制性内切酶(NEB)，引物合成(Invitrogen)，Taq DNA聚合酶、SYBR green real-time PCR kit(宝生物工程)，PCR产物纯化试剂盒(上海生工)，pEASY-T5 Zero Cloning Kit(北京全式金)，琼脂糖(Biowest)，Applied Biosystem 7900HT PCR仪，Bio-Rad水平电泳仪，Gold-SIM凝胶成像系统，OptimaTML-XP超速离心机。

mtDNA标准品制备我们将mtDNA片段克隆至质粒载体作为拷贝数定量的标准品。其制备方法如下：取健康成人外周全血200 μl，按照Blood mini DNA isolation kit(Qiagen)操作说明提取全基因组DNA(含mtDNA)。利用获得的全基因组DNA作为模板，进行普通PCR反应，引物序列为mt-DNA片段PCR前引物(Mito-F)：5′-C￣A￣C￣T￣T￣T￣C￣C￣A￣C￣A￣C￣A￣G￣A￣C￣A￣T￣C￣A-3′ ；mt-DNA片段PCR后引物(Mito-R)：5′-T￣G￣G￣T￣T￣A￣G￣G￣C￣T￣G￣G￣T￣G￣T￣T￣A￣G￣G￣G-3′，产物127 bp，反应体系50 μl：5 μl 10倍浓缩PCR缓冲液(含2 mmol/L Mg2+)，4 μl dNTP (每种dNTP 2.5 mmol/L)，1 μl上游、下游引物(10 mmol/L)，1 μl DNA 模板，加ddH2O补足至50 μl。PCR热循环：95℃ 2 min模板变性后，进行35个95℃/30s、55℃/30s、72℃/30s循环，于72℃ 充分延伸10 min。反应结束后，PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，验证扩增产物。

新鲜扩增的产物利用生工PCR产物纯化试剂盒进行纯化，并用Nanodrop 2000测定浓度。按pEASY-T5 Zero Cloning Kit操作说明，按比例加入目的片段和pEASY-T5 Zero T载体，室温反应5 min。将该连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，用氨苄青霉素平板选择转化子，挑取转化子菌落培养，用质粒提取试剂盒抽提质粒，进行PCR、Nco Ⅰ 酶切及测序鉴定。经鉴定正确的阳性质粒作为标准品备用。

实时定量PCR标准曲线的制作采用SYBR Green Ⅰ 染料法，在Applied Biosystem 7900HT PCR仪建立标准曲线，反应体系为25 μl，以出现最小的阈值循环数(CT值)和最高的荧光值及不出现非特异的扩增产物为标准，分别对模板浓度、退火温度和引物浓度进行优化。将制备的mtDNA质粒用Nanodrop 2000测定OD 260 nm计算质粒浓度，质粒OD 260 nm/OD 280 nm比值在1.8～2.0方可用来制备标准曲线。利用双链DNA拷贝数计算器 (http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html)将质粒质量换算成拷贝数,再用无DNase ddH2O 10倍梯度稀释成107、106、105、104、103、102拷贝各5 μl。以此为模板，建立25 μl反应体系，根据优化的反应条件，在Applied Biosystem 7900HT PCR仪上扩增。反应结束后，导出数据，利用Excel软件计算标准曲线。

实时定量PCR产物的特异度及重复性试验以质粒标准品为模板，进行普通PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；进行实时定量PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳分析和熔解曲线分析。重复性检测时，将质粒标准品稀释成3个浓度梯度，组内重复性试验时，每个稀释度重复10孔；组间重复性试验时，同 1次反应每个稀释度重复4孔，重复 4次反应。

血清DNA提取采集健康对照和局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者各2 ml全血，室温放置30 min，16 000 g，4℃离心10 min，每个研究对象取200 μl血清，按照DNeasy Blood & Tissue Kit(#69504)说明书进行DNA提取，用200 μl AE 缓冲液进行洗脱。提取的DNA放-20 ℃备用。

微囊泡(MV)提取

人永生化足细胞(HPC)MV提取参考Thery等[17]方法，足细胞经37℃、5% CO2培养分化8～10d后，吸除RIPM1640完全培养基，加入20 ml无血清RIPM1640培养基，设立对照组和嘌呤霉素氨基核苷(PAN)组。PAN组予终浓度为50 μg/ml 的PAN处理24h后，将培养上清移入离心管，于4℃依次进行下列离心：2 000 g，20 min；10 000 g，30 min；100 000 g，70 min。最后一次离心的沉淀即为MV，用200 μl HBSS反复吹吸溶解。留取部分样品用于蛋白浓度测定，其余部分放-80℃备用。

尿液MV提取参考Gonzales等[18]方法，收集健康成人和FSGS患者尿液各30 ml，加入蛋白酶抑制剂，于4℃进行系列梯度离心：17 000g，10 min；200 000 g，1h。离心结束后，用200 μl PBS反复吹吸溶解。留取部分样品测定蛋白浓度，其余部分放-80℃备用。

MV中DNA提取取溶解的MV 200 μl，加入DNase Ⅰ (Ambion 2222) 1 μl，37℃孵育30 min，然后75℃ 10 min灭活DNase Ⅰ，再按照DNeasy Blood & Tissue Kit(#69504)说明书进行DNA提取，用100 μl AE buffer 进行洗脱。获得的DNA用Picogreen dsDNA quantification kit定量。

统计学分析采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，所有数据均为3次独立实验结果，以均数±标准差表示，两组之间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

质粒标准品的制备本研究中所用pEASY-T5 Zero T载体全长3 831 bp，在其克隆位点上下游存在M13F/M13R通用测序位点。当127 bp的mtDNA片段插入后，M13F/M13R测序引物的PCR产物大小会相应增加(约300 bp)。该对引物对阳性克隆(Mito质粒)的PCR产物凝胶分析结果与预期相符(图1A)。Mito质粒经NcoI酶切后，线性化片段约4 kb(图1B)。最后，Mito质粒的测序结果(图1C)证实了127 bp mtDNA片段的存在。因此，我们成功构建了mtDNA质粒标准品。

图1　Mito质粒PCR产物(A)、限制酶酶切(B)及测序图谱(C)分析

mtDNA定量标准曲线的制作为将质粒质量换算成拷贝数，用无DNase ddH2O 10倍梯度稀释成107、106、105、104、103、102、101拷贝各5 μl。在25 μl的反应体系内，加入12.5 μl 2X SYBR mix、0.5 μl ROX dye、0.25 μl上、下游引物(Mito-F，Mito-R，10 μmol/L)、5 μl 上述质粒DNA稀释液、6.5 μl ddH2O；热循环条件为95℃/30s预变性，40个循环的95℃/5s和60℃/30s。mtDNA绝对定量的典型熔解曲线，扩增曲线和标准曲线见图2。

熔解曲线表明扩增产物形成单一的特异性熔解峰，Tm值在83.3～83.5℃(图2A)；qPCR即real-time PCR扩增样品经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，仅含与预期目的片段大小一致的扩增产物，无其他产物出现(图2B)。扩增曲线显示，除最高稀释度样品(101拷贝/5 μl)外，所有样品的目的产物呈指数扩增，即扩增效率为100%，因此，该方法的mtDNA检测下限为102拷贝/5 μl(图2C)。标准曲线表明，标准品模板浓度与CT值呈现良好的线性关系，R2均>0.99，斜率在3.0～3.3(图2D)。对三个浓度梯度进行重复性分析，结果表明无论是组内差异还是组间差异均<3%(表1)。

图2　线粒体DNA拷贝数定量

表1　实时定量PCR重复性检测

FSGS患者血清mtDNA拷贝数利用所建立的mtDNA拷贝数定量方法，我们检测健康对照(n=6)和FSGS患者(n=10)血清mtDNA拷贝数，结果显示FSGS患者血清mtDNA拷贝数较健康对照明显下降，(P<0.05)(图3)。

图3　健康对照及FSGS患者血清mtDNA拷贝数比较

FSGS患者尿液MV来源mtDNA的变化尿液MV中包含的蛋白、microRNA、mRNA、DNA等均是潜在的生物标志物[21,22]。我们猜测，尿液MV可能含有mtDNA，且尿液中MV mtDNA的浓度可能与疾病状态相关。为证明该猜测，本研究利用建立的mtDNA定量方法对FSGS患者尿液MV mtDNA的含量进行检测。留取5例正常人对照和5例FSGS患者尿液30 ml，提取MV及其DNA，取相同体积DNA样品进行qPCR，结果显示，FSGS组的尿液MV mtDNA浓度明显高于正常对照组(图4A)。值得注意的是，本研究发现，FSGS患者尿液MV的含量也显著高于正常对照(根据MV蛋白总量测定，图4B)，提示FSGS患者MV mtDNA浓度的升高可能主要是由MV含量的增加造成。

图4　FSGS患者尿液MV中mtDNA变化

PAN处理的足细胞所分泌的MV中mtDNA的变化近年来，已有数篇文献提及体外培养的细胞分泌的MV中含有mtDNA[19,20]。我们推测，受损伤刺激的足细胞所分泌的MV，其mtDNA含量可能出现变化，从而反映足细胞的损伤而成为标志物。为此，我们利用所建立的mtDNA定量方法，对正常培养的和PAN刺激的HPC所分泌的MV进行mtDNA的定量检测和比较，结果显示正常培养的HPC的MV确实含有mtDNA，约为1 000 个拷贝/ng MV总DNA量。PAN处理HPC 24h后，分泌的MV中mtDNA水平则明显下降(图5)。同时，我们还对PAN处理的HPC内mtDNA含量进行了测定，结果显示PAN同样降低了HPC细胞内的mtDNA拷贝数(图6)。这一结果表明，MV内mtDNA含量的变化能反映细胞内的mtDNA含量的变化。

图5　PAN处理的HPC分泌的MV中mtDNA变化情况

图6　PAN处理的HPC内mtDNA拷贝数变化情况

讨　　论

疾病的诊断及分期有赖于良好的生物标志物的发现，而越来越多的证据表明循环mtDNA水平与多种疾病的发生发展存在着关联性，同时由于其浓度及拷贝数较高，方便检测，从而有望成为新的生物标志物。Malik等[23]指出由于基因组存在着大量mtDNA的假基因，所以在进行实时qPCR定量时候，引物的选择显得尤为重要，该作者通过对mtDNA的片段化，再将其与BLAST数据库比对，最后获得两对mtDNA特异性的引物。本研究即采用其中一对，以外周血DNA为模板PCR扩增出目的片段，连接T载体，构建了质粒标准品，并且制作了基于SYBR Green Ⅰ实时PCR的mtDNA定量的标准曲线，结果显示，该质粒标准品与CT值的线性关系很好，直线回归方程的相关系数R2>0.99。此外，该方法敏感度高 ，检出下限达到100拷贝/5μl；特异性强，扩增产物熔解曲线仅单一的熔解峰，琼脂糖凝胶电泳仅唯一的特异性条带；重复性好，质粒标准品组内及组间变异系数均<3%。

已有研究证实，创伤[24,25]、酸碱烧伤[26]、重症[27]、肿瘤[8]患者循环mtDNA升高，同时在大鼠缺血性休克模型中，循环mtDNA水平可持续升高一周左右[28]。Venhoff等[29]对77例系统性红斑狼疮(SLE)患者循环mtDNA水平进行检测发现，所有患者循环mtDNA水平均升高。那么，肾脏疾病患者的循环mtDNA水平是否异常呢？本研究利用建立的方法,对6例健康对照及10例FSGS患者血清mtDNA水平进行检测发现，FSGS患者血清mtDNA均较健康对照下降。当然，由于样本量太小，该结果尚需大样本验证,但至少可以明确肾脏损伤时，循环mtDNA水平不一定升高，甚至可以是下降的。对循环mtDNA水平变化的研究可能加深对肾脏疾病发病机制的了解。

MV是近年来发现的一种细胞间信号交流的新方式，直径在40～1 000 nm[30]。2009年,Guescini等[19，20]首先提出培养的星形胶质细胞和胶质母细胞分泌的MV中含有mtDNA,后续他们又证实了C2C12肌成纤维细胞分泌的MV中含有mtDNA,并提出MV装载mtDNA可能作为细胞间mtDNA平行转运的方式，用以修复受体细胞中mtDNA的损伤。本研究也证实，体外培养的足细胞分泌的MV中也含有mtDNA,提示细胞分泌的MV包含mtDNA可能是普遍现象，而并不是某种或某一类细胞所特有。同时，本研究还发现PAN处理足细胞后，不仅细胞分泌的MV中mtDNA拷贝数下降，而且足细胞内的mtDNA拷贝数也下降。因此，足细胞MV中的mtDNA含量变化有可能反映足细胞损伤状态，并成为其损伤标志物。我们进一步推测，通过分离肾脏疾病患者尿液足细胞来源的MV，并测定其mtDNA的含量，有可能推断其足细胞的损伤状态。由于Hagiwara等[31]发现PAN大鼠FSGS模型无论是肾皮质还是肾小球中mtDNA拷贝数均下降，与本研究体外足细胞损伤模型的结果一致，我们可以利用该模型，分离尿液中足细胞来源的MV，分析其mtDNA水平，从而确定在肾脏疾病患者，尿液足细胞MV 的mtDNA能否作为足细胞损伤的生物标志物。

尿液MV主要由泌尿系统上皮细胞分泌，其中包含的蛋白质、microRNA、mRNA均是肾脏疾病潜在的生物标志物[22,32]。Sharma等[33]研究发现糖尿病肾病患者尿液MV中mtDNA拷贝数下降，提示尿液MV mtDNA是潜在的肾脏疾病的生物标志物。然而，Kitada等[34]研究发现2型糖尿病模型db/db小鼠肾脏中mtDNA拷贝数较db/m正常对照鼠增加；Malik等[35]也发现2型糖尿病GK大鼠模型中，肾组织中mtDNA拷贝数也增加，因此，尿液MV中mtDNA含量不能反映糖尿病肾组织mtDNA的变化，原因可能是尿液MV来源复杂。前文提到，提取尿液中足细胞来源的MV，并分析其mtDNA的变化，有可能反映足细胞内mtDNA的水平及损失情况。本研究利用所建立的方法对FSGS患者尿液MV中mtDNA拷贝数进行检测，结果发现FSGS患者尿液MV来源的mtDNA含量较健康对照明显上升，但同时发现，FSGS患者尿液MV的含量也上升，提示FSGS患者尿液MV来源的mtDNA的升高主要是由MV的升高造成的。值得注意的是，本研究发现当用尿液MV中总DNA量校准尿液MV中的mtDNA量时，FSGS患者与健康对照无明显差异(数据未显示)，可能的原因是FSGS患者尿液MV中的总DNA量及种类的变化复杂，与尿液MV mtDNA的含量不是呈简单的线性关系有关，此外，本研究样本量偏小，也是需要考量的因素之一。总之，尿液中总MV的mtDNA是否与肾脏疾病相关，尚需进一步确定。

综上所述，肾脏疾病可能与mtDNA水平的变化相关联，因此，血清，血浆，尿液，肾组织细胞中的mtDNA有可能成为肾脏疾病诊断的生物标志物。本研究建立的mtDNA拷贝数测定方法为进一步开展这项研究奠定了基础。

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