一株枯草芽孢杆菌对芘的降解特性及代谢途径的研究

姚 俊，喻 婵，靳竞男

（北京科技大学土木与环境工程学院环境与能源国际合作基地，北京100083）

多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是常见的一类环境污染物［1－2］，广泛分布于水体、空气及土壤中。由于其在环境中的半衰期较长和致癌、致畸、致突变的性质而日益受到人们的重视［3］。PAHs具有较低的水溶性［4］，高分子量的PAHs在环境中的存留时间较长，导致这类化合物在环境中很难被去除［5］。美国环保局在20世纪80年代初将16种未带分支的PAHs确定为环境中的优先控制污染物［6］。利用微生物去除环境中的PAHs因费用低、易操作及不造成二次污染而逐渐成为研究热点［7］。

作者从大港油田原油样品中筛选获得1株可以以芘（代表性PAHs）作为唯一碳源和能源进行生长的菌株，对其降解特性和降解产物进行了测定，进一步提出了该菌株对芘的降解代谢途径。

1 实验

1.1 样品及培养基

原油样品取自大港油田港西区块58－8－3＃油井。

无机盐培养基（g·L－1）［8］：（NH4）2SO43，KH2PO40.5，Na2HPO4·12H2O 1.26，MgSO4· 7H2O 0.54，FeCl3·6H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.03，MnSO4·H2O 0.015，ZnSO4·7H2O 0.024，CoCl2· 6H2O 0.366，调节pH值至7.2～7.4。固体培养基中添加2%的琼脂，121℃灭菌30min。

LB培养基（g·L－1）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，调节pH值至7.0。固体培养基中添加2%的琼脂，121℃灭菌30min。

1.2 菌种筛选

将样品以2%的接种量接种于以芘为唯一碳源的无机盐培养基中，好氧条件下于28℃、180r·min－1摇床培养7d，相同条件下转接1次。采用稀释涂平板法涂于以芘为唯一碳源的无机盐固体培养基上，于28℃恒温摇床培养7d形成单菌落。挑取生长迅速、边缘整齐的菌落接入无机盐培养基中，摇瓶复筛，得到目的菌株。

1.3 芘降解菌株的鉴定

将目的菌株在28℃LB培养基中振荡培养至对数生长期，取1.5mL培养液以12 000r·min－1离心，收集菌体。采用OMEGA公司提供的细菌基因组DNA小量快速提取试剂盒提取该菌株的总DNA，将其置于－20℃保存，备用。

以总DNA为模板，采用引物27F（5′－AGAGTT TGATCCTGGCTCAG－3′）和1492R（5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′）［9］进行PCR扩增。反应体系20μL，其中PCR mix 10μL，总DNA 0.5μL，正、反引物各0.4μL，ddH2O 8.7μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经过纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳。

16SrDNA序列由华大基因公司测定。测定结果在GenBank上与已知种属的16SrDNA序列进行Blast比对［10］，利用Mega4对获得的同源性序列进行分析并构建系统进化树。

1.4 菌株生长曲线的测定

目的菌株经LB液体培养基活化后，取1mL菌液接种于芘浓度为100mg·L－1的50mL无机盐培养基中进行培养，待OD600≈0.25时，以2%的接种量接入以芘为唯一碳源的无机盐培养基中，于28℃、180r ·min－1进行培养，每个样品做3个平行，以未接菌株的无机盐培养基为空白，每2d测1次OD600。

1.5 芘降解率的测定

活化菌株在芘浓度为100mg·L－1的培养基中进行培养，待OD600≈0.25时，以2%的接种量接入以芘为唯一碳源的无机盐培养基中，于28℃、180r· min－1进行培养。取5mL正己烷与5mL菌液混合，超声数分钟后，静置约10min分层。收集上层有机相和下层水相。重复此操作2次，合并有机相，弃下层水相。将有机相过无水硫酸钠柱除去水分，蒸发浓缩至2mL，进行GC－MS分析。

1.6 芘降解代谢产物的测定

GC－MS条件：进样口无分流模式，温度250℃，HP－5弹性石英毛细管色谱柱（30m×0.25mm，0.25 μm），柱子流量为1.1mL·min－1，炉温60℃保持1 min，以15℃·min－1升到150℃保留1min，再以6℃·min－1升到320℃保留10min。进样口和检测器的温度分别为250℃和300℃。载气（氦气）流速为1.1mL·min－1。空白样品为未接菌的样品。

2 结果与讨论

2.1 菌株的鉴定

经过富集、驯化及纯化，筛选得到1株芘降解菌株，命名为USTB－Y。菌体形态为杆状，菌落呈圆形，边缘呈锯齿状，中间凸起，乳黄色，表面光滑，湿润。

将测得的16SrDNA序列在GenBank中进行Blast比对，获得的同源性序列均为Bacillus属，其中与Bacillus amyloliquefaciens strain BC7的同源性高达97%。进一步构建系统进化树，确定该菌株在所属种属中的亲缘关系，如图1所示。

图1 芘降解菌USTB－Y的系统进化树Fig.1 Phylogenetic positions of USTB－Y on 16SrDNA analysis

从图1可以看出，USTB－Y和Bacillus amyloliquefaciens strain BC7的亲缘关系最近，可以推断此菌株属于芽孢杆菌属。

2.2 菌株USTB－Y对芘的降解特性（图2）

图2 菌株USTB－Y的生长曲线及芘降解率随时间变化曲线Fig.2 The growth curve of strain USTB－Y and the variation curve of pyrene degradation rate with time

从图2可以看出，菌株USTB－Y在以芘为唯一碳源的无机盐培养基中生长经历延迟期、对数期、稳定期及衰亡期这4个时期，在第8d时生长速率达到最快，OD600值为0.206，较以LB为培养基时的生长速率慢，可能是由于无机盐培养基是一种缺陷型培养基，细菌在此培养基中生长能力较差。

从图2还可以看出，菌株USTB－Y逐渐降解芘，在16d时对芘的降解率高达约56%，由于此时培养基中的菌株大部分处于衰亡期，所以基本认为测定的降解率为最高。表明，USTB－Y是1株能够有效降解芘的菌株。

2.3 芘降解代谢产物的测定

通过GC－MS分析，检测到菌株USTB－Y对芘的降解过程中产生的一系列代谢产物，如图3所示。

从图3可以看出，检测到的代谢产物有1－羟基芘、芘酮、邻苯二甲酸酯和1－羟基苯。

根据所检测到的代谢产物，参考Bacillus amyloliquefaciens strain BC7，推测菌株USTB－Y降解芘可能存在的代谢途径，如图4所示。

图3 菌株USTB－Y降解芘的代谢产物Fig.3 The metabolites formed from pyrene utilization by strain USTB－Y

图4 菌株USTB－Y降解芘的可能代谢途径Fig.4 Proposed pathway for the degradation of pyrene by strain USTB－Y

从图4可以看出，菌株USTB－Y以芘为唯一碳源和能源进行生长的过程中，芘的芳香环上4位的碳首先受到单加氧酶或双加氧酶的攻击，形成水二醇；进一步转化为1－羟基芘，接着转化为芘酮或其它代谢产物；再进一步降解形成邻苯二甲酸酯，转化为邻苯二甲酸，最终进入三羧酸循环被完全降解。

3 结论

自大港油田港西区块58－8－3＃油井原油样品中筛选得到1株能以芘为唯一碳源和能源生长的菌株USTB－Y。形态鉴定及16SrDNA鉴定表明，此菌株属于芽孢杆菌属，与Bacillus amyloliquefaciens strain BC7的同源性高达97%。对其生长曲线及对芘的降解率测定表明，在以芘为唯一碳源的无机盐培养基中培养16d后，芘的降解率高达56%，被认为是对芘具有高效降解效果的菌株。进一步对菌株USTB－Y降解芘的代谢产物进行测定，提出了该菌株降解芘的可能代谢途径。

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